楊 濱,李婉萍,婁曉明,姜 囡,姜麗紅

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院,沈陽(yáng) 110004；2解放軍 463醫(yī)院)

石榴皮是石榴科植物石榴的干燥果皮,性酸、味澀,具有澀腸、止血、殺蟲(chóng)的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,石榴皮具有抗病毒、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等作用,從其當(dāng)中提取的多酚具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[1,2]。石榴皮多酚的提取及提取物的抗氧化、抑菌作用已有報(bào)道[3,4],而對(duì)石榴皮多酚提取物的抗腫瘤活性研究較少。2008年 4月 ～2009年 7月,本研究探討了石榴皮多酚的提取及其對(duì)人宮頸癌 He-La細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Folin-Denis試劑(100 g鎢酸鈉、20 g磷鉬酸、50 ml 85%磷酸和 750 ml蒸餾水混合,沸水浴中回流 2 h,冷卻后定容至 1 L)。蘇木素配制:蘇木精 0.4 g溶于 50 ml無(wú)水乙醇,硫酸鋁 2 g溶于150 ml蒸餾水,二者混勻,加熱至沸騰,加入碘酸鈉0.1 g和檸檬酸 0.2 g。沒(méi)食子酸 (色譜純)(TREECHEM標(biāo)準(zhǔn)品系列)及各種有機(jī)溶劑(分析純)均購(gòu)自沈陽(yáng)新興試劑廠；HeLa細(xì)胞株購(gòu)自中科院,由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮多酚提取方法優(yōu)化 石榴皮 40℃烘干,研磨成粉末后按下述方法進(jìn)行多酚提取。①浸提法:取 20 g石榴皮粉末,以 20%(體積分?jǐn)?shù))乙醇作溶劑,料液比(g∶ml)1∶20,溫度 50 ℃,提取時(shí)間 1 h。②索氏回流法:取 20 g石榴皮粉末置于索氏提取器中,20%乙醇水溶液 400 ml于 80℃回流 2 h。③微波法:將 20 g石榴皮干粉浸于 400 ml 20%乙醇水溶液中,置于實(shí)驗(yàn)用微波爐中加熱 2 min,反復(fù) 3次。處理后的樣品均用布氏漏斗抽慮,將濾液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小體積后定容為 30 ml,加 40 ml甲醇、80 ml氯仿,萃取5 h。取上層非脂質(zhì)部分,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),0.45μm水膜過(guò)濾,定容至 5 ml。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定 總多酚含量的測(cè)定采用Folin-Denis法,以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)石榴皮中總多酚做定量分析:①繪制多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線:稱取0.05 g沒(méi)食子酸,配制成 0.1 mg/ml的水溶液；分別取 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml 6個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度設(shè) 3個(gè)平行管,加入 2.5 ml Folin-Denis試劑,反應(yīng) 5 min后加 2 ml 75 g/L的碳酸鈉溶液,用蒸餾水定容至 10 ml后 50℃水浴 5 min,冷卻 2 h后以蒸餾水調(diào)零。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,在 760 nm處有特征吸收峰,以該波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。②不同方法提取石榴皮多酚含量測(cè)定:從各方法制備的樣品中精確吸取 0.5 ml石榴皮多酚粗提液,每個(gè)樣品做 3個(gè)平行,按照上述方法測(cè)定提取物多酚的含量。

1.2.3 粗提物抗腫瘤活性測(cè)定 將 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液中,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.3.1 MTT法檢測(cè)多酚粗提物對(duì) HeLa細(xì)胞增殖的影響 分別將 3種提取物的粗提液濃縮后用 2 ml PBS溶出,過(guò)濾除菌,稀釋為不同濃度。將 HeLa細(xì)胞以每孔 200μl接種于 96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度為每孔 104個(gè),培養(yǎng) 12 h,使其充分貼壁,然后換液為無(wú)血清的 RPMI-1640培養(yǎng),24 h后換液為含濃度分別為 0、10、20、40、80、160、320 μg/ml多酚粗提物的無(wú)血清 RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),每個(gè)濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔,CO2培養(yǎng)箱中孵育 24 h。每孔加入 5 mg/ml MTT 20μl,繼續(xù)放入 5%的 CO2培養(yǎng)箱中染色 4 h,吸去上清,加入 200μl DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)形成的結(jié)晶,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng) 490 nm處的吸光度(OD)值,計(jì)算粗提物對(duì) HeLa細(xì)胞的抑制率。抑制率(%)=(空白孔 OD值 -實(shí)驗(yàn)孔 OD值)/空白孔 OD值×100%

1.2.3.2 Transwell法檢測(cè)多酚粗提物對(duì) Hela細(xì)胞的侵襲抑制作用 包被基底膜(鋪膠):冰上操作,按體積比 1∶7稀釋過(guò)夜解凍的 Matrigel,充分混勻后按每小室 100μl鋪膠至 Transwell小室內(nèi)部的膜上,置 37℃培育 3 h。將 Transwell小室放入 24孔板中,下室加入含 10%血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液 500 μl,取細(xì)胞懸液 100μl加入上室,細(xì)胞數(shù)為 1×105/孔,在上室加入多酚粗提物至終濃度為 0、10、20、40、80、160、320 μg/ml,每個(gè)樣本重復(fù) 3次,37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng) 24 h,取出 Transwell小室,PBS輕輕沖洗,上下各沖洗 1次,用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞,甲醇室溫下固定 15 min,蘇木素染液染色 40 min后蒸餾水沖洗。用倒置顯微鏡(200×)對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本選取 5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞,取其均數(shù)。抑制率(%)=(空白孔細(xì)胞數(shù) -實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞數(shù))/空白孔細(xì)胞數(shù) ×100%。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 提取效率結(jié)果 沒(méi)食子酸在 0～0.10 mg/ml的濃度范圍內(nèi)與其 OD值呈良好線性關(guān)系。浸提法、索氏提取法、微波提取法提取的多酚含量分別為(17.30±0.01)、(16.62±0.02)、(23.08±0.01)g/100 g。

2.2 多酚粗提物對(duì) HeLa細(xì)胞增殖的影響 低濃度多酚粗提物(10μg/ml)對(duì) HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用并不明顯(P＞0.05),但隨著濃度升高抑制作用逐漸增強(qiáng),40μg/ml的多酚粗提物對(duì) HeLa細(xì)胞增殖有明確的抑制作用(P＜0.05),多酚粗提物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制的半數(shù)抑制濃度 (IC50)為78.13 μg/ml。

2.3 多酚粗提物對(duì) HeLa細(xì)胞侵襲的影響 0、10、20、40、80、160、320 μg/ml的多酚粗提物導(dǎo)致 HeLa細(xì)胞遷移的個(gè)數(shù)分別為 234、162、110、58、45、32、24個(gè),抑制率分別為 0、30.73%、52.92%、75.25%、80.94%、86.20%、89.76%,由此可見(jiàn),隨著多酚粗提物濃度的增加,HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)減少,細(xì)胞遷移能力下降。

3 討論

微波提取法具有高效性、強(qiáng)選擇性、操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、產(chǎn)物易于純化等特點(diǎn)[5],故微波法提取多酚類活性物質(zhì)已被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)石榴皮多酚提取率進(jìn)行系統(tǒng)研究,進(jìn)一步驗(yàn)證了微波提取法較浸提法、索氏回流法更具優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多酚具有很強(qiáng)的抗癌活性,其中對(duì)于茶多酚的研究最為深入。通過(guò)大量的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),茶多酚不僅有化學(xué)防癌的作用,還可以直接殺傷癌細(xì)胞[6]。其中最為典型的多酚類化合物是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG),它可使 PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在 G2/M期,誘導(dǎo) Molt B細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,并且具有強(qiáng)烈的和直接的抑制端粒酶的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)石榴皮多酚對(duì)宮頸癌 HeLa細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用,且效果顯著,該結(jié)果為石榴皮多酚作為抗腫瘤藥物提供了一定的理論依據(jù)。

[1]魏玉西,孫峋,王長(zhǎng)云,等.鼠尾藻多酚的抗腫瘤活性研究[J].中草藥,2008,39(1):93-95.

[2]Yuan YV,Walsh NA.Antioxidant and antiproliferative activities of extracts from a variety of edible seaweeds[J].Food Chem Toxicol,2006,44(7):1144-1150.

[3]李建科,李國(guó)秀,趙艷紅,等.石榴皮多酚組成分析及其抗氧化活性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(11):4035-4041.

[4]宋薇薇,焦士蓉,周佳,等.石榴皮多酚的微波輔助提取及提取物抗氧化與抑菌作用研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(1):23-27.

[5]付為琳,楊立剛,孫桂菊.微波萃取在菊花黃酮提取工藝中的應(yīng)用研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2008,29(1):1-3.

[6]Liao S,Umekita Y,Guo J,et al.Growth inhibition and regression of human prostate and breast tumors in athymic miceby teaepigallocatechin gallate[J].Cancer Lett,1995,96(2):239-243.

[7]Naasani I,Seimiya H,Tsuruo T,et al.Telomerase inhibition,telomere shortening,and senescence of cancer cells by tea catechins[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,249(2):391-396.