王 榮，李長生

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院，山東 濟南 250014； 2.山東省千佛山醫(yī)院中醫(yī)科，山東 濟南 250014）

血管新生（angiogenesis）是指從原有的血管上生出新的毛細血管，包括內(nèi)皮細胞增殖、遷移、細胞間黏附、排成直線及形成開放的腔樣結(jié)構(gòu)，此過程還包括血管基底膜及細胞外基質(zhì)的降解。腦缺血時，血管新生對神經(jīng)系統(tǒng)的成型及保護具有重要的作用，它不僅可為損傷組織提供必要的營養(yǎng)支持，還可以使炎性細胞浸潤，促進損傷組織的清除，在一定程度上減少神經(jīng)功能的缺失［1］。腦缺血時，血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為最重要的血管生成因素之一，表達增加，促使血管形成。Notch/Delta信號通路是廣泛存在于脊椎和非脊椎動物的重要信號傳導(dǎo)通路，對血管的發(fā)生發(fā)展有重要調(diào)控功能。本文擬從血管新生過程、VEGF和Notch/Delta信號通路二者的相互作用方面做一總結(jié)。

1 VEGF的結(jié)構(gòu)及其生物活性

VEGF是 1989年由 Ferrara N等［2］在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)液中分離出的一種可擴散的內(nèi)皮細胞特異性的分裂原，后來發(fā)現(xiàn)與1983年報道的在腫瘤細胞系培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種能影響腫瘤微血管通透性的蛋白，即血管通透因子（vascular permability factor，VPF）同屬一物。血管內(nèi)皮細胞生長因子是最重要的血管生成因素之一，正常腦組織中只有少量VEGF表達。缺血缺氧時，VEGF表達顯著增加，通過與其受體的相互作用調(diào)控內(nèi)皮細胞分化、增殖和血管形成［3］。

1.1 VEGF家族及其受體

VEGF是由二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，相對分子量為34 kDa～45 kDa，其編碼基因位于染色體6q21.3，長約14 kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子交替構(gòu)成。VEGF家族現(xiàn)發(fā)現(xiàn)5個成員：VEGF-A（即通常所指的 VEGF）、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD以及胎盤生長因子。人類VEGF由于基因剪切方式的不同可形成多種多肽產(chǎn)物，主要有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189 和 VEGF206， 其中VEGF165在細胞中含量最豐富，大腦中尤以VEGF165最多。

目前比較肯定的VEGF受體主要有3種：①Fam樣酪氨酸激酶受體（Fam-like tyrosine kinase receptor，F(xiàn)lt-1/VEGFR-1），主要與內(nèi)皮細胞的形態(tài)發(fā)生及調(diào)節(jié)有關(guān)；②激酶插入域或胎肝激酶受體（kinase insert domain-containing receptor/fetal liver kinase，KDR/Flk-1/VEGFR-2），主要調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞的分裂、增殖及血管通透；③VEGFR-3/Flt-4，激活該受體主要引起淋巴管內(nèi)皮細胞增生［4］。VEGF主要通過VEGFR-1與VEGFR-2在內(nèi)皮細胞上發(fā)揮作用，其中VEGFR-2為發(fā)揮作用的主導(dǎo)受體，可與所有形式的VEGF相互作用，是誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖分化的主要介質(zhì)［5］，VEGF直接的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用也與VEGFR-2有關(guān)。Jin K L等［6］的實驗證實，VEGF可減少體外模擬腦缺血環(huán)境培養(yǎng)的NH33神經(jīng)細胞系死亡，在缺氧和無葡萄糖狀態(tài)培養(yǎng)下，VEGF可使NH33細胞存活數(shù)量增加1倍。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)此時NH33細胞中可檢測出VEGFR-2和nertopilin-1表達，而沒有VEGFR-1表達。同樣條件下加入nertopilin-1配體胎盤生長因子，發(fā)現(xiàn)其并不具備類似VEGF的神經(jīng)保護作用，所以推測VEGF神經(jīng)保護作用位點是VEGFR-2。

1.2 VEGF表達的調(diào)控

VEGF基因表達受多種因素調(diào)控，缺氧是最有力的誘導(dǎo)因素。VEGF基因的啟動子區(qū)含有缺氧誘導(dǎo)因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1） 反應(yīng)元件，缺氧/低氧時，HIF-1可與VEGF基因5′端低氧反應(yīng)元件結(jié)合，通過環(huán)二磷酸鳥苷酸（cGMP）途徑調(diào)節(jié)VEGF表達［7］。在腦梗死早期，缺血區(qū)半暗帶內(nèi)氧含量不足，低氧作為刺激信號通過HIF-1使缺血區(qū)半暗帶VEGF及其受體表達增強，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增生，形成大量新血管，建立側(cè)枝循環(huán)，改善缺血區(qū)供氧狀況，促進該區(qū)神經(jīng)和細胞功能的恢復(fù)，減輕缺血引起的腦損傷。

在不同的腦缺血狀態(tài)下，VEGF mRNA、VEGF蛋白和VEGF受體的表達在時間和分布上存在一定的差異性。Lennmyr F等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）2 h 再灌注早期，VEGF mRNA表達并未增加，并且隨存活時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。

1.3 VEGF在血管新生中的主要作用

VEGF在血管新生中的主要作用包括促血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移；誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞上相應(yīng)配體和受體表達；增加細胞間黏附分子和血管細胞黏附分子的水平；上調(diào)內(nèi)皮細胞表面整合素受體的表達，誘使骨橋黏合蛋白與之結(jié)合；上調(diào)絲氨酸蛋白酶活性，從而降解稠密的細胞外基質(zhì)，促進血管形成。

Chen H H等［9］在大腦中動脈缺血再灌注（MCAO）動物模型中發(fā)現(xiàn)，血管新生在缺血1 w～2 w明顯可見，在缺血半暗帶區(qū)最為明顯，此區(qū)血流量減少，但并非完全阻斷，此處血流量的細微差異就足以決定細胞是否存活。Marti H J等［10］的研究表明，MCAO后24 h血管內(nèi)皮細胞開始增生，血管樣結(jié)構(gòu)從軟腦膜和腦實質(zhì)的血管向缺血區(qū)發(fā)展。永久性局灶性腦缺血半暗帶區(qū)的VEGF表達于缺血后2 d～14 d內(nèi)持續(xù)增高，新血管的形成始于缺血后6 h～24 h，并一直延續(xù) 28 d［11］。 Sun Y 等［12］對 MCAO 大鼠腦內(nèi)注射外源性VEGF，通過第Ⅷ因子（vWF）免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)，VEGF注射組新生血管比正常組高2倍，比缺血對照組高4倍。

2 Notch/Delta信號通路的結(jié)構(gòu)及生物活性

2.1 Notch/Delta信號通路的結(jié)構(gòu)

Notch/Delta通路是廣泛存在于脊椎和非脊椎動物的重要信號傳導(dǎo)通路，與其他多個高度保守的細胞傳導(dǎo)通路一起構(gòu)筑起生物發(fā)展的信號骨架，決定細胞的命運，影響器官形成［13］。有研究報道Notch/Delta信號通路對血管的發(fā)生發(fā)展，包括細胞增殖、遷移、平滑肌分化、血管生成、動靜脈分化等多個方面有重要的調(diào)控功能［14］。Notch受體是由Notch基因編碼的一組高度保守的跨膜蛋白，在鄰近細胞產(chǎn)生的配體的活化作用下，通過一系列分子間的相互作用，精確地調(diào)控各譜系細胞的增殖分化［15］。在脊椎動物中，Notch受體有4種同源體，即Notch1～Notch 4。整個分子跨越細胞膜，其表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）重復(fù)序列能與配體結(jié)合并激活Notch信號。Notch具有多種配體，稱為Delta配體家族。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物中有 Delta1、Delta-like3（Dll3）、Delta-like4（Dll4）、Jagged1、Jagged2。Notch 基因編碼的蛋白合成后先在胞內(nèi)糖基化遞呈到細胞膜上，再與鄰近細胞膜上的配體連接；然后，在胞外區(qū)S2位點由金屬蛋白酶介導(dǎo)裂解，隨后由早老素依賴的γ-分泌酶（γ-secrease）介導(dǎo)的胞內(nèi)區(qū)S3位點發(fā)生裂解，釋放的NICD進入細胞核內(nèi)，與胞核上的靶基因結(jié)合形成多蛋白-DNA復(fù)合體轉(zhuǎn)錄因子CSL，激活相關(guān)基因Hes1/5等并進行轉(zhuǎn)錄，生成Hes1/5等編碼的核bHLH蛋白家族成員；繼而激活、調(diào)節(jié)其下游的靶基因，最終影響細胞的分化、增殖和凋亡。

2.2 Notch/Delta信號通路與血管新生

Notch受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了新生血管的形成［16］，而Gridley T最新的一系列實驗表明Notch受體與鄰近細胞的Delta樣配體4（delta-like ligand 4，Dll-4）共同調(diào)節(jié)了該過程［17］。

Notch4是特異性分布在血管內(nèi)皮并且是分布在毛細血管內(nèi)皮上的唯一的Notch受體，在Notch信號調(diào)控血管內(nèi)皮發(fā)生發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用［18］。Krebs L T等［16］實驗結(jié)果表明Notch4調(diào)控血管發(fā)生發(fā)育、血管網(wǎng)形成，抑制后期血管分支發(fā)育，其表達較正常增多或減少都會使血管發(fā)育受損。作為Notch配體之一，Dll4是一種重要的血管生長發(fā)育調(diào)節(jié)因子，主要存在于胚胎和成年組織的血管內(nèi)皮細胞［19］。 Hofmann J J 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，Dll4 主要在新生血管末端頂細胞中表達，Dll4的組織定位暗示它與新生血管的生長和發(fā)育有著密切聯(lián)系。

Gridley T［17］發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺血缺氧時，內(nèi)皮細胞 Dll4表達上調(diào)，激活鄰近細胞Notch4受體，進而啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)Notch/Delta信號通路的靶基因Hes3、Shh表達而促使血管發(fā)生和形成。Androutsellis-Theotokis A 等［21］進一步實驗表明，用分泌酶抑制劑抑制Dll4的表達，則內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管網(wǎng)形成均受到抑制，血管形成減少。這一過程中，細胞間質(zhì)信號 （包括絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt和轉(zhuǎn)錄因子STAT3）也被快速激活。Dll4-Notch信號的正常傳遞有利于新生血管中特定類型細胞的密度、位置和行為方式的確立，最終保證正常血管的形成。

3 VEGF與Notch/Delta信號通路共同調(diào)節(jié)血管新生

有研究報道，VEGF可以誘導(dǎo)動脈內(nèi)皮細胞中Dll4和其受體Notchl表達，但內(nèi)皮細胞中Dll4的過表達可以減弱VEGF誘導(dǎo)的細胞增殖和遷移。這個事實說明，VEGF是Dll4的正向調(diào)節(jié)因素，而Dll4是 VEGF 信號的負調(diào)節(jié)因素［22］。 Suchting S 等［23］通過實驗證明，當(dāng)VEGF信號途徑被阻斷后，小鼠血管內(nèi)皮頂端細胞中Dll4的表達減少，從而使血管分支發(fā)育過程受阻。Leslie J D等［24］研究發(fā)現(xiàn)Dll4-Notch信號缺陷時正常情況下停止生長的內(nèi)皮細胞持續(xù)增殖和遷移，若VEGF和Dll4-Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被同時阻斷，則內(nèi)皮細胞保持靜止?fàn)顟B(tài)不再增殖。結(jié)合這一系列的實驗可以得出，作為血管形成正向調(diào)節(jié)因子的VEGF，通過誘導(dǎo)Dll4的表達而啟動Dll4-Notch信號，作為負的反饋調(diào)節(jié)因素而有效預(yù)防過量的血管形成，從而促進一個分化良好的血管網(wǎng)根據(jù)環(huán)境的需要而及時形成。

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