張祥勝,向廷生
(1.山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250100;2.長江大學(xué) 地球化學(xué)系,湖北 荊州 434023)
目前大多數(shù)市售的表面活性劑主要是來自石油基的化學(xué)產(chǎn)品,其生產(chǎn)過程需要消耗大量的石油產(chǎn)品,易污染環(huán)境,而且受到原材料、價(jià)格和產(chǎn)品性能等因素的影響,在生產(chǎn)和使用過程中常常會帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題以及對人體的毒害問題。而生物表面活性劑則不存在這樣的問題,因而日益受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注,成為近年來的研究熱點(diǎn)。
生物表面活性劑是由微生物在一定條件下產(chǎn)生的同時(shí)具有親水性和疏水性兩種結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物,按分子量大小,可分為低分子和高分子兩類生物表面活性劑。低分子生物表面活性劑能有效降低表面或界面張力,其中以枯草芽孢桿菌的surfactin最為有名[1];高分子生物表面活性劑主要功能不在于降低界面張力,而是分布在油滴的表面,對油/水界面表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力,從而有效地阻止它們的聚并,可使乳狀液得以穩(wěn)定,因此又稱生物乳化劑。研究最早也最為詳細(xì)的高分子生物表面活性劑是來自醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)RAG-1的Emulsan[2,3]。本文中所指表面活性劑主要指前一種。
同一般化學(xué)合成的表面活性劑一樣,生物表面活性劑具有以下特點(diǎn):具有顯著降低表面張力、較低的臨界膠束濃度,對溫度、pH和鹽度不敏感,還具有專一性強(qiáng),低毒性、可生物降解、環(huán)境友好、可利用廉價(jià)農(nóng)副產(chǎn)品生物發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),某些生物表面活性劑還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用及生理活性。生物表面活性劑已在石油[4,5]、食品、化妝品及藥學(xué)等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用[6]。另外,在疏水性污染物(石油、有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴等)污染土壤的生物修復(fù)中也發(fā)揮了巨大作用[7,8]。
提高代謝物的產(chǎn)量一般通過兩種方法,即優(yōu)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和通過各種技術(shù)手段來提高菌株的產(chǎn)量與活性。使用誘變或重組高產(chǎn)菌來提高產(chǎn)量還處于研究的初級階段,其中誘變由于使用經(jīng)濟(jì)方便,因而成為獲得生物表面活性劑高產(chǎn)菌的一種重要方法[9],尤其是物理因子法以其安全、設(shè)備簡單、操作方便、價(jià)格低廉、誘變率高等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的特別關(guān)注[10]。
微生物誘變育種常用的物理因素主要是各類輻射,其實(shí)質(zhì)是造成不致死但修復(fù)錯(cuò)誤的損傷,引起輻照細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)(主要是DNA)發(fā)生點(diǎn)突變或染色體畸變,從而有可能提高產(chǎn)量[11],具體過程主要包括物理階段、物理化學(xué)階段、化學(xué)階段以及生物學(xué)效應(yīng)4個(gè)階段。
物理因素包括紫外線(非電離輻射)和電離輻射。而低能離子束作為一種較新穎的誘變源,雖然也是電離輻射,但由于其獨(dú)特性,單獨(dú)加以介紹。在國外,各種輻射主要用于放射生物學(xué)或癌癥放療的研究,故生物表面活性劑產(chǎn)生菌的物理誘變的資料較少。本文主要介紹國內(nèi)的研究進(jìn)展情況。
紫外線照射波長范圍為10-380nm,其引起生物體的主要損傷是相鄰堿基形成二聚體,阻礙堿基的正常配對而導(dǎo)致堿基置換突變[12],用紫外線輻射產(chǎn)表活微生物以獲得高產(chǎn)菌株的文獻(xiàn)報(bào)道較多。
宋紹富等對高效驅(qū)油菌I進(jìn)行紫外誘變,培育出代謝性能較好的菌株,發(fā)酵液的界面張力可由6.49 mN/m降低到5.86 mN/m,降低了9.7 %[13]。Mulligan等對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株ATCC 21332進(jìn)行紫外誘變,將原菌株培養(yǎng)到對數(shù)期并轉(zhuǎn)移大約300個(gè)細(xì)菌到營養(yǎng)瓊脂平板上,然后用短波紫外燈輻射大約35 s,得到產(chǎn)量提高3-4倍多的突變株[14]。
電離輻射主要用的是γ射線和X射線。Raza[14]對惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida 33)進(jìn)行γ射線誘變,得到突變株300-B,使用不同的疏水性碳源(烴類、植物油提煉廠廢物等)對該突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)鼠李糖脂,得到最大生物量3.5 g·L-1、最大鼠李糖脂產(chǎn)量為4.1 g·L-1。Iqbal 等對銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa) S8進(jìn)行γ射線誘變,得到以烴為碳源的高產(chǎn)表活突變菌EBN-8。突變體用原油烴為碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基時(shí)表現(xiàn)出比出發(fā)菌株高3-4倍的烴乳化和轉(zhuǎn)化能力,在以十七烷為碳源時(shí)也表現(xiàn)出較高的表活產(chǎn)率(以乳化指數(shù)和無細(xì)胞發(fā)酵液的表面張力為指數(shù)),同時(shí)生長速率增加了2-3倍[15]。
在產(chǎn)表面活性劑菌種改良方面,中國科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室走在前列。劉清梅用低能離子束誘變改良產(chǎn)脂肽枯草芽孢桿菌,應(yīng)用參數(shù)為能量20 keV、劑量2.6×1015N+/cm2,經(jīng)過多輪誘變得到一株表面活性大為提高的突變菌株E-8。該菌株Landy培養(yǎng)基的去細(xì)胞發(fā)酵液稀釋50倍和100倍后,其表面張力值為27.1 mN/m和28.5 mN/m,分別比出發(fā)菌同等條件下表面活性提高4.6倍和16.4倍。而該菌株的生長特性和表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生特性與出發(fā)菌株相比,變化不明顯[16]。在此基礎(chǔ)上,對培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,并成功轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品[6],商品名為莎梵婷,獲得了可觀的經(jīng)濟(jì)和社會效益。同時(shí)用低能離子輻照勝利油田油層中分離得到的一株細(xì)菌Sp-5-3,最終得到一株產(chǎn)物乳化性能大為提高的突變菌株S-34[17]。但除此之外,幾乎沒有報(bào)道,最新相關(guān)綜述文章認(rèn)為離子束誘變技術(shù)在獲得生物表面活性劑高產(chǎn)菌上還沒有應(yīng)用,并且還認(rèn)為離子束誘變獲得的突變菌株回復(fù)突變率較高[9]。但依筆者的體會和其他研究者的文獻(xiàn)報(bào)道,顯然這是不科學(xué)的觀點(diǎn)。這也說明,由于離子束生物工程學(xué)裝置造價(jià)較高(目前市場價(jià)約100萬元/臺),應(yīng)用相對較少[18],國內(nèi)生物表面活性劑研究者多數(shù)還沒有認(rèn)識到離子束誘變技術(shù)的作用。離子束誘變技術(shù)仍是獲得生物表面活性劑高產(chǎn)菌有潛力的手段之一。
霍丹群等用自主研制的基于梳狀交叉微電極陣列結(jié)構(gòu)的細(xì)胞電操作系統(tǒng),開展產(chǎn)表面活性劑BS-37菌株選育研究,獲得一株高產(chǎn)菌,其表面張力從51.47 mN/m降低至37.59 mN/m,乳化力從62 %升高至85 %[19]。另外,以下幾種新型的誘變技術(shù)值得注意,但目前應(yīng)用于產(chǎn)表活微生物的研究未見報(bào)道。
一是空間誘變育種。又稱航天育種或太空育種,是指利用返回式衛(wèi)星、飛船或高空氣球?qū)⑸锊牧洗钶d到太空,利用太空特殊的環(huán)境(空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素)對生物材料進(jìn)行誘變,再返回地面選育新種質(zhì)、新材料,培育新品種的生物育種新技術(shù)。這些空間條件都有可能引起微生物發(fā)生遺傳性變異。空間突變的最大特點(diǎn)是突變頻率高、突變譜廣、變異幅度大、變異性狀穩(wěn)定快從而使育種周期縮短、生物安全性提高[20,21]。
二是微波輻射。屬于一種低能電磁輻射,具有較強(qiáng)生物效應(yīng)的頻率范圍在300 MHz-300 GHz,對生物體具有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。在這兩種效應(yīng)的綜合作用下,生物體會產(chǎn)生一系列突變效應(yīng)。 目前主要應(yīng)用于曲霉、沙門氏菌、酵母[22]、孢霉屬真菌[23]等。如,在白僵真菌的誘變效果上,微波略優(yōu)于紫外線,而且操作更簡單[24]。
三是激光。為一種量子流。激光作用于生物組織后產(chǎn)生熱、壓力、光化和電磁場等的現(xiàn)象,起主要作用的是光效應(yīng)和電磁場效應(yīng),引起細(xì)胞染色體畸變效應(yīng)、酶的激活或鈍化,以及細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝活動的改變[25]。激光誘變技術(shù)具有操作簡單、安全、變異率高、輻射損傷輕等優(yōu)點(diǎn),在微生物育種實(shí)踐中取得了一定成果。激光可應(yīng)用于微生物誘變育種和介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因,具有較大的潛力[26]。目前湖南師范大學(xué)激光輻射生物實(shí)驗(yàn)室的研究較為領(lǐng)先。
在利用單一物理因子作用于微生物的同時(shí),開始嘗試用多種物理因子組合作用微生物。但在產(chǎn)表活菌的改良上用的不多。常見的組合是屬非電離輻射的紫外與屬電離輻射的離子束、γ射線的組合。
劉七[27]等以自行分離的兼性厭氧菌I為出發(fā)菌株,經(jīng)過紫外和甲基磺酸乙酷復(fù)合誘變,得到1株性能優(yōu)良的變異新菌株,可將界面張力從6.49 mN/m降低到4.36 mN/m,降低了32.8 %。沈薇等以產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的銅綠假單胞菌BS-03為出發(fā)菌株,對其進(jìn)行UV和UV+LiCl的誘變,篩選得到1株產(chǎn)量提高了1.658倍(由4.1 g·L-1提高到6.89 g·L-1)的菌株LY4[28]。
物理因子的生物效應(yīng)研究是生命科學(xué)的重要內(nèi)容,也是物理學(xué)與生物學(xué)自身發(fā)展、相互滲透、分支交融的必然結(jié)果。物理因子誘變微生物的研究與應(yīng)用具有極其重要的實(shí)踐意義[10]。下面就以下幾個(gè)問題展開討論。
傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)中存在的突變不定向、效率低、性質(zhì)不穩(wěn)定、有益突變率低、易發(fā)生回復(fù)突變等缺點(diǎn)[9],尤其是即使是一些新型的物理誘變技術(shù),如離子束、低溫等離子體、激光、微波和空間誘變技術(shù)等,也是不定向的。因此,綜合運(yùn)用物理誘變技術(shù)(主要是非電離輻射誘變與電離輻射誘變相結(jié)合)或?qū)⑽锢碚T變技術(shù)與化學(xué)誘變技術(shù)、基因工程技術(shù)等相結(jié)合,努力提高誘變效率、獲得穩(wěn)定的突變體等,是大有可為的。尤其是根據(jù)菌種改良技術(shù)的進(jìn)步和實(shí)際需要,發(fā)展定向物理誘變技術(shù),是目前的努力方向之一。
自身產(chǎn)物的誘變技術(shù)也有報(bào)道。例如秦新政等對鼠李糖脂生產(chǎn)菌種假單胞菌進(jìn)行高濃度的鼠李糖脂處理,獲得了產(chǎn)量提高50 %以上的突變株[29]。Carrera Paolo等人專利報(bào)道培育成一株耐反饋抑制的枯草芽孢桿菌菌株ATCC55033,在反應(yīng)器中加入其自身合成的脂肽時(shí),對自身生長影響有限,對脂肽的合成也無抑制作用,由此脂肽產(chǎn)量提高了1倍[30]。今后在進(jìn)行物理誘變時(shí),也可以借鑒這一研究思路,即在高濃度的產(chǎn)物添加到篩選平板和搖瓶中,期望得到抗反饋抑制或阻遏的突變株。
測定生物表面活性劑產(chǎn)生的方法有:液滴坍塌法[31,32]、排油圈法和血平板裂解法[33]。血平板法的缺點(diǎn)是,如果血平板制作不好則不易發(fā)現(xiàn)溶血圈,直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察,也不能用于需要烴類物質(zhì)才產(chǎn)生表面活性劑的微生物的篩選,而且溶血活性也可能與微生物存在溶血酶有關(guān),而不是因?yàn)槲⑸锂a(chǎn)生了生物表面活性劑。96孔板液滴坍塌法,被國外研究者認(rèn)為是一種高通量分析技術(shù)[31],且精度較高,但操作繁瑣,且不適宜檢測低劑量表面活性[32,34]。排油圈法是較為常用的一種方法。表面活性劑濃度與排油圈直徑和培養(yǎng)液表面張力之間都呈線性關(guān)系,通過它們之間的線性圖,根據(jù)其中的一個(gè)參數(shù)就能計(jì)算出另外兩個(gè)參數(shù)[35]。如果能用血平板篩選的,盡量用血平板篩選,畢竟平板篩選還是便捷高效的方法,大分子乳化劑往往不能產(chǎn)生溶血圈,或是以烴為碳源的產(chǎn)表活菌也不能用血平板篩選,可以考慮用油平板[36]或藍(lán)色凝膠平板篩選[37],也可以改進(jìn)配方,比如用發(fā)酵培養(yǎng)基做基本培養(yǎng)基,再加CTAB和亞甲基藍(lán)。如不能用平板進(jìn)行篩選,則可以采用發(fā)酵后測定發(fā)酵液無細(xì)胞上清的排油圈的方法進(jìn)行篩選,取排油圈較大的測表面張力,結(jié)合測定發(fā)酵液的乳化能力,并最終以粗提物產(chǎn)量為復(fù)篩的指標(biāo)。
在高產(chǎn)育種實(shí)踐中,為了提高篩選效果,在平板初篩時(shí),可采用小瓊脂塊大通量篩選法。小瓊脂塊大通量篩選法是日本學(xué)者八木建立,后用于春雷霉素選育,篩選效果良好[38]。但這種方法要求菌落及產(chǎn)物擴(kuò)散性好,故更適于放線菌和絲狀真菌的抗生素產(chǎn)量性狀的篩選,實(shí)際上目前大多數(shù)文獻(xiàn)處理材料都是這兩類微生物[39,40]。筆者曾嘗試采用該法篩選產(chǎn)糖脂的假單胞菌高產(chǎn)菌株,實(shí)際操作中遇到一些問題,如瓊脂塊易干燥,采取保濕措施則易污染,細(xì)菌菌落擴(kuò)散很慢,達(dá)不到瓊脂塊的邊緣,瓊脂塊與篩選平板結(jié)合的緊密程度影響糖脂在篩選平板中的擴(kuò)散,即使是同一個(gè)菌株,透明圈直徑差異也較大等,但相信采取適當(dāng)?shù)拇胧朔щy,即可使這一高通量篩選方法在產(chǎn)表活高產(chǎn)菌篩選中獲得應(yīng)用。
目前中國在開發(fā)和改良產(chǎn)表活微生物方面仍與國外有較大差距,如國外已經(jīng)將糖脂或脂肽產(chǎn)量提高到50 g·L-1的水平[30],在產(chǎn)量方面仍需努力,但品質(zhì)方面仍要重視。研究和應(yīng)用最廣泛的是糖脂,其中又以銅綠假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂為主[29],脂肽類表面活性劑研究得不太多。同是10 g·L-1的產(chǎn)量,糖脂和脂肽的功性顯然是不同的,或是誘變后的產(chǎn)量雖然有了大幅度提高,但如果品質(zhì)下降或性能下降,顯然也沒有達(dá)到預(yù)期目的。當(dāng)然,也有研究者已經(jīng)認(rèn)識到這方面的問題。Noha H.Youssef等為了研究207個(gè)產(chǎn)表活菌株分別進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)后提取表面活性劑發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌類主要產(chǎn)脂肽類表面活性劑,其表面活性與結(jié)構(gòu)存在重要相關(guān),尤其是脂肽的脂肪酸的含量[41]。國內(nèi)采用離子誘變獲得的突變菌株的分子量1 022 Da的環(huán)脂肽類表面活性物質(zhì)比國內(nèi)外研發(fā)的1 036 Da環(huán)脂肽少一個(gè)亞甲基(-CH2),其表面活性更強(qiáng),CMC 值僅為1 μM,在濃度低至20 μM 就可將水的表面張力從72 mN/m降低到27 mN/m,是有文獻(xiàn)記載的最強(qiáng)的生物表面活性劑[3,16]。
目前,生物表面活性劑只有少數(shù)產(chǎn)品走向市場,大多數(shù)品種還都處于實(shí)驗(yàn)研究階段,還沒有進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn),這主要是由于生產(chǎn)成本較高。而決定生物表面活性劑生產(chǎn)成本的主要因素有菌株、原料、發(fā)酵工藝和下游技術(shù)等,其中菌株是重中之重。只有不斷改進(jìn)物理因素誘變手段在內(nèi)的菌株改良技術(shù),不斷培育可低成本發(fā)酵、品質(zhì)優(yōu)良、抗逆性好的高產(chǎn)菌株,才能大幅度提高生物表面活性劑與化學(xué)表面活性劑的性價(jià)比,為生物表面活性劑的推廣奠定良好基礎(chǔ)。而物理因素的誘變技術(shù)由于成本低、起點(diǎn)低、易在基層單位和企業(yè)推廣等優(yōu)點(diǎn),即使在基因工程技術(shù)大發(fā)展的今天,仍有旺盛的生命力和應(yīng)用價(jià)值,尤其是新型物理因素的誘變技術(shù),更是值得大力推廣。目前作者所在的石油地質(zhì)微生物技術(shù)課題組,應(yīng)用離子束在內(nèi)的誘變源,對自有的石油微生物進(jìn)行誘變改良,取得了良好的效果,可望在不久即獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株,并在盡快在油田及化工等企業(yè)推廣應(yīng)用。
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