張立鋼，趙玉紅，李 莉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；2.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040）

紅松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）為松科，松屬，常綠針葉喬木，是主產(chǎn)于中國小興安嶺的珍貴樹種。紅松籽又稱為海松籽、新羅（朝鮮）松籽[1]。紅松松仁蛋白質含量在13%～20%，氨基酸種類齊全，是一種優(yōu)良的植物蛋白源[2]，以紅松松仁為原料生產(chǎn)既有營養(yǎng)性，又有功能性的產(chǎn)品具有廣闊的前景。利用酶水解蛋白質生產(chǎn)生物活性肽是蛋白質利用的有效手段之一。生物活性肽具有易消化吸收的特點，不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)成分，還可調節(jié)機體的免疫功能、促進礦物質的吸收、調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、并有抗氧化、降血壓、降血脂、降膽固醇、護肝、抗菌等作用[3－4]。研究表明，多種蛋白水解獲得的多肽都具有良好的免疫調節(jié)功能，能調動機體自身免疫系統(tǒng)，促進自身免疫能力的提高。多肽以其分子質量低、活性強、用量少的獨特優(yōu)勢，越來越多地引起人們的重視，其工業(yè)化生產(chǎn)也成為當前食品和醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的大趨勢[5]。

目前，對多種不同來源的蛋白酶解獲得生物活性肽進行免疫功能研究的報道較多[6－8]，但對松仁蛋白肽相關研究未見報道。本文研究松仁蛋白多肽對小鼠免疫功能的影響，通過測定免疫器官重量、細胞免疫功能、體液免疫功能、單核－巨噬細胞的吞噬功能，測定松仁多肽對小鼠的免疫調節(jié)作用，以此作為松仁多肽功能性食品產(chǎn)品開發(fā)利用的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松仁多肽精制品（Pine kernel polypeptide，PKP）實驗室自制；昆明種雄性小鼠購自黑龍江省哈爾濱鐵路局腫瘤醫(yī)院；綿羊紅細胞（SRBC）；印度墨汁購自上海長江日用粘合材料廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

722S可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BPN恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；游標卡尺，哈爾濱量具刃具廠；微量注射器，江西僑明醫(yī)療器械有限公司；微量血凝試驗板、血色素吸管、計時器等。

1.3 方法

1.3.1 松仁多肽制備工藝流程

松仁粗蛋白→脫脂→酶解→滅酶（100℃，5 min）→離心（4 500 r·min－1，5 min）→上清液→真空冷凍干燥→松仁多肽粗品→復溶→Sephadex G－25凝膠過濾層析（以0.02 mol·L－1pH 7的磷酸鹽緩沖液洗脫）→冷凍干燥→松仁多肽精制品（PKP）。

1.3.2 試驗動物及分組

昆明種雄性小鼠，體重18～20 g。按體重隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組各40只，分別將松仁多肽精制品以150、300、600 mg·kg－1·d－13 個劑量灌胃 3 個試驗組，對照組給以同等體積蒸餾水。各組均自由飲水、攝食。

1.3.3 臟器/體重的測定

小鼠飼喂30 d后，稱重，處死，取其肝、脾和胸腺，用濾紙吸干表面血污，稱重，記錄數(shù)據(jù)。按照公式（1）和（2）進行計算[9]。

1.3.4 細胞免疫功能的測定

采用DTH－足跖增厚法（遲發(fā)型變態(tài)反應）對小鼠細胞免疫功能進行檢測[10]。

小鼠飼喂30 d后，用體積分數(shù)為2%SRBC免疫，每只鼠腹腔注射 0.2 mL（約 1.00×108個SRBC）。免疫后4 d，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射體積分數(shù)為20%SRBC，每只鼠注射 20 μL（約 1.00×108個 SRBC），于注射后24 h分別測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。以處理前后足跖厚度差值（足跖腫脹度）來表示DTH程度。

1.3.5 體液免疫功能的測定

采用血凝法（血清溶血素的測定）對小鼠體液能免疫功能進行檢測[11]。

小鼠飼喂30 d后，每只鼠腹腔注射0.2 mL的2%SRBC進行免疫，4～5 d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2 000 r·min－1離心 10 min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝試驗板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。

血清凝集程度分5級（0－Ⅳ） 記錄，按公式（3）計算抗體積數(shù)，比較受試組和對照組的抗體積數(shù)差異。

式中，1，2，3，……，n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。

0級－紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。

Ⅰ級－紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀，四周有少量凝集的紅細胞。

Ⅱ級－凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。

Ⅲ級－凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。

Ⅳ級－凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

1.3.6 單核－巨噬細胞功能的測定

采用小鼠碳廓清試驗對小鼠單核－巨噬細胞的吞噬功能進行檢測[12]。

將飼喂30 d的小鼠稱重，尾靜脈注射稀釋的墨汁（每10 g體重注射0.1 mL），立即計時，2 min后用毛細管從眼眶靜脈叢取血20 μL，迅速將其加入到2 mL Na2CO3溶液中，混勻。以Na2CO3溶液作為空白對照，在600 nm處測定光吸收值（OD1）；10 min后，再次從眼眶靜脈叢取血20 μL，將其加入到2 mL Na2CO3溶液中，測定光吸收值（OD2）。由公式（4）和（5）計算吞噬指數(shù)α值：

式中，t2－tl代表測定的間隔時間（min）。

1.3.7 氨基酸組成的測定

用氨基酸自動分析儀進行氨基酸組成分析，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院測試中心測定。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，通過單因素方差分析（One－way ANOVA）來評價結果的統(tǒng)計差異性。

2 結果與分析

2.1 松仁肽組成分析

松仁蛋白經(jīng)酶解制得松仁蛋白肽粗品后，利用層析技術（Sephadex G－25凝膠過濾）進行分離制備松仁蛋白多肽，圖1為層析分離結果。

圖1 Sephadex G-25分離松仁多肽洗脫圖Fig.1 Elution curve of hydrolysates with Sephadex G-25 gel column

由圖1可知，松仁蛋白多肽由PKP1－7共7個組分構成。通過對比同一條件下標準蛋白層析結果可知：PKP1、PKP2組分分子質量大于23 105 u，為未充分水解的松仁蛋白；PKP3組分分子質量大約為3 776 u，該組分是松仁蛋白多肽；PKP4－7組分分子質量低于249 u，由游離氨基酸、二肽或三肽構成。

氨基酸組成分析結果表明，PKP3組分谷氨酸和精氨酸這兩種氨基酸含量相比其他氨基酸豐富，分別為19.98%和16.86%。精氨酸可有效地增強體液免疫，促進免疫球蛋白的產(chǎn)生，甚至可以對抗糖皮質激素的免疫抑制作用[13－14]。因此對PKP3組分進行小鼠免疫功能試驗。

2.2 小鼠臟器/體重比

收集PKP3，冷凍干燥得到松仁多肽精制品（PKP）。按照公式（1）和（2）計算灌喂30 d后臟體比。結果見表1。由表1可知，松仁多肽對小鼠臟器重量和臟體比有影響。PKP高劑量組小鼠脾臟重和脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），中劑量組脾臟指標高于對照組，但差異不顯著；PKP中、高劑量組小鼠胸腺重和胸腺指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），高劑量組胸腺指數(shù)與對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。由試驗結果可見，中劑量（300 mg·kg－1·d－1）攝入即可引起小鼠免疫器官的顯著變化。

表1 PKP對小鼠免疫器官重量的影響Table 1 Effects of PKP on weights of immune organs in mice(±S,n=10)

表1 PKP對小鼠免疫器官重量的影響Table 1 Effects of PKP on weights of immune organs in mice(±S,n=10)

注：*代表差異顯著（P＜0.05）；**代表差異極顯著（P＜0.01）。以下同。Note:*denote significant difference at 0.05 level;**denote extremely significant difference at 0.01 level.The same as below.

脾臟Spleen組別Group對照組Control group 150 mg·kg－1·d－1脾臟重（g）Spleen weight 0.1528±0.0210 300 mg·kg－1·d－1 0.1427±0.0212 0.1625±0.0179 600 mg·kg－1·d－10.2120±0.0150*脾臟指數(shù)（%）Spleen index 0.5441±0.0755 0.5320±0.0467 0.5962±0.0295 0.8002±0.1291*胸腺Thymus胸腺重（g）Thymus weight 0.0588±0.0070 0.0640±0.0015 0.0870±0.0111*0.0892±0.0120*胸腺指數(shù)（%）Thymus index 0.2074±0.0273 0.2209±0.0144 0.3235±0.0109*0.3334±0.0023**

2.3 小鼠細胞免疫功能

采用DTH－足跖增厚法（遲發(fā)型變態(tài)反應）測定PKP對小鼠細胞免疫功能的影響，結果見表2。

表2PKP對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）的影響Table 2 Effects of PKP on delayed type hypersensitivity reaction(DTH)in mice(±S,n=10)

表2PKP對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）的影響Table 2 Effects of PKP on delayed type hypersensitivity reaction(DTH)in mice(±S,n=10)

組別Group對照組Control group 150 mg·kg－1·d－1 24 h足跖增厚（cm）Increased metatarsus thickness,after treatment 24 h 0.0253±0.0260 300 mg·kg－1·d－1 0.0614±0.0220*0.0621±0.0190*600 mg·kg－1·d－10.0600±0.0290*

由表2可知，試驗組小鼠在攝入PKP 30 d之后，表現(xiàn)出對SRBC誘發(fā)的遲發(fā)型變態(tài)反應的增強作用，表現(xiàn)在24 h后足跖的增厚，3個試驗組中中等劑量組（300 mg·kg－1·d－1）足跖增厚最高。低劑量組（150 mg·kg－1·d－1）、中劑量組（300 mg·kg－1·d－1）和高劑量組（600 mg·kg－1·d－1）在處理 24 h 后足跖增厚高于對照組（P＜0.05）。由試驗結果可知，PKP對SRBC誘發(fā)的遲發(fā)型變態(tài)反應有促進作用，可作為免疫促進劑對小鼠的細胞免疫功能產(chǎn)生影響。

2.4 小鼠體液免疫功能

采用血凝法（血清溶血素測定）測定PKP對小鼠體液免疫功能的影響，根據(jù)血清凝集程度的級別，按公式（3）計算抗體積數(shù)，比較受試組和對照組的抗體積數(shù)差異?？贵w積數(shù)越大，表示血清抗體越高。結果見表3。

表3 PKP對小鼠體液免疫功能的影響Table 3 Effects of PKP on humoral immunity function in mice(±S,n=10)

表3 PKP對小鼠體液免疫功能的影響Table 3 Effects of PKP on humoral immunity function in mice(±S,n=10)

組別Group對照組Control group 150 mg·kg－1·d－1血清溶血素Serum hemolysin 19±1.2 300 mg·kg－1·d－1 39±3.5**45±2.4**600 mg·kg－1·d－148±4.5**

由表3可知，PKP攝入使小鼠的血清在更高的稀釋度下使SRBC凝集，即具有更高的抗體水平，隨著劑量的增高，抗體積數(shù)增加。試驗組（150、300 和 600 mg·kg－1·d－1）小鼠的抗體積數(shù) （血清凝血素水平）高于對照組（P＜0.01）。可見，PKP能增強小鼠的體液免疫功能。

2.5 小鼠單核-巨噬細胞功能

采用小鼠碳廓清試驗測定PKP攝入對小鼠單核－巨噬細胞吞噬功能的影響。由公式（4）、（5）計算吞噬指數(shù)α值，以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清能力，結果見表4。

表4 PKP對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響Table 4 Effects of PKP on macrophage phagocytosis function of the mice(Xˉ±S,n=10)

由表4可知，PKP攝入對小鼠的單核－巨噬細胞的吞噬功能有影響，試驗組吞噬指數(shù)高于對照組。中劑量組（300 mg·kg－1·d－1）小鼠的吞噬指數(shù)最高，吞噬功能最強，其次為低劑量組，再次為高劑量組。中劑量組（300 mg·kg－1·d－1）與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）?？梢?，中等劑量PKP可提高小鼠的單核－巨噬細胞的吞噬功能。

3討 論

3.1 松仁多肽的構成與免疫功能的關系

松仁蛋白經(jīng)酶解可以制得不同分子質量的肽，經(jīng)凝膠過濾層析得到的松仁多肽，主要組分分子質量大約為3 776 u。多肽氨基酸構成與對于機體的免疫功能有關，精氨酸對機體免疫具有調節(jié)功能，主要是通過精氨酸－NO途徑以及對內(nèi)分泌激素的影響實現(xiàn)[14]，精氨酸可促進細胞免疫功能，引起胸腺重量增加增強巨噬細胞吞噬能力，增強體液免疫，促進免疫球蛋白產(chǎn)生。松仁多肽的氨基酸分析結果表明，層析分離的7個組分中，松仁多肽PKP3中精氨酸含量高達16.86%，針對這一組分進行免疫功能研究，符合本研究的目標和進行深入研究松仁蛋白功能性實際意義。

3.2 松仁多肽對小鼠免疫器官的影響

免疫系統(tǒng)是機體內(nèi)擔負免疫功能的物質結構，由免疫器官、免疫細胞和免疫分子構成，它們是機體免疫應答的物質基礎。免疫器官按作用不同，分為中樞免疫器官和外周免疫器官。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是外周免疫器官，二者均是體內(nèi)的主要免疫器官，與體液免疫和細胞免疫均有密切關系[15]。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小直接反映機體免疫水平的高低。

在本研究中，PKP的攝入能顯著增大小鼠免疫器官，這與其他肽制備物對小鼠免疫功能的影響相似，如紅三葉寡肽也使小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)增加[16]。中等劑量使小鼠胸腺指數(shù)增高，而高劑量同時增加脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。這種現(xiàn)象可以看作松仁多肽對免疫器官直接刺激的結果。兩指數(shù)都增加，說明PKP對細胞免疫和體液免疫都有促進作用。

3.3 松仁多肽對小鼠細胞免疫功能的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應又稱“遲發(fā)型超敏反應”，屬IV型變態(tài)反應，是由T淋巴細胞介導的一種超敏反應，無需抗體或補體參加，在變應原作用下形成致敏淋巴細胞，當再次接觸相同變應原時，表現(xiàn)出一種遲緩的、以單個核細胞浸潤和細胞變性壞死為特征的局部變態(tài)反應性炎癥，在24～48 h達到高峰然后逐漸消退。

本研究中以足跖厚度變化值來表示遲發(fā)型變態(tài)反應的程度，PKP的攝入使小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應增強，低、中和高劑量組小鼠的足跖變化顯著高于對照組。各劑量組引起的遲發(fā)變態(tài)反應在中等劑量時最強。

3.4 松仁多肽對小鼠體液免疫功能的影響

抗體是機體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，具有結合抗原和激活補體等多種生物學功能，血清抗體水平可反映機體免疫力的高低。

血清中溶血素含量的高低是衡量體液免疫的重要指標[17－18]。通過測定血清中溶血素（抗體）含量即可反映出食源性生物活性肽對體液免疫的影響。在肽對于小鼠免疫功能研究中，紅三葉寡肽可以顯著提高小鼠體液免疫功能[16]，本研究中，PKP的攝入使小鼠的體液免疫水平提高（P＜0.01），表明PKP是調節(jié)體液免疫應答水平的重要物質，通過調節(jié)細胞因子的生成發(fā)揮調節(jié)機體免疫功能的作用。

3.5 松仁多肽對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

單核－巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一[19]。當細菌、異物等抗原性物質進入機體后，可被單核－巨噬系統(tǒng)迅速吞噬和清除，因而巨噬細胞廓清指數(shù)可以反映其吞噬功能的強弱[8]。巨噬細胞有吞噬、處理和呈遞抗原，激活淋巴細胞和分泌多種可溶性因子以加強淋巴細胞活性的功能，參與免疫反應的傳入支；同時它也是免疫效應細胞，能殺死細菌和腫瘤細胞，引起組織損傷，而參與免疫反應的傳出支。在免疫反應中，免疫細胞通過直接接觸和它們分泌的可溶性因子發(fā)揮免疫調節(jié)和免疫效應作用。

本研究發(fā)現(xiàn)PKP攝入引起的小鼠單核－巨噬細胞的吞噬能力增強，表現(xiàn)出隨著PKP攝入劑量升高而出現(xiàn)先升高再降低的趨勢，具有劑量效應關系，這種變化趨勢與酶解雞蛋清小肽混合物對小鼠免疫功能的影響相似[20]。對于松仁多肽，在中等劑量時，單核－巨噬細胞功能增強相比對照組達到顯著水平。這表明，適當劑量的松仁多肽對小鼠非特異免疫功能有提高作用。

4 結論

松仁蛋白多肽對小鼠具有免疫調節(jié)功能，表現(xiàn)出增加正常小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，增強小鼠細胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細胞的吞噬功能，由此可認為松仁蛋白多肽能增強小鼠免疫功能。

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