張 威，白艷菊*，張勻華，申 宇，高艷玲，耿宏偉，范國權，孟憲欣

（1.黑龍江省農業(yè)科學院植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農業(yè)科學院植物保護研究所，哈爾濱 150086；3.黑龍江省農業(yè)科學院作物育種研究所，哈爾濱 150086）

韭蔥黃條病毒（Leek yellow stripe virus，LYSV）是馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus的典型成員，病毒粒子為彎曲線狀，無包膜，長度為680～900 nm，直徑11～12 nm，是侵染大蒜的主要病毒。LYSV是單鏈正義RNA病毒，基因組全長10 142 bp，5′端具有病毒基因組結合蛋白VPg，3′端具有Poly（A），基因組含一個開放閱讀框（ORF），翻譯成一個具有蛋白酶功能的多聚蛋白，再自身酶解成包括外殼蛋白在內的10個多肽[1-2]。LYSV由蚜蟲以非持久方式傳播，廣泛分布于世界各大蒜種植區(qū)[3]，嚴重影響大蒜的產量和品質。

黑龍江省發(fā)展大蒜產業(yè)具有得天獨厚的地理、氣候優(yōu)勢，在哈爾濱市阿城區(qū)、寧安市、富錦縣、訥河縣、綏陵縣等地均大面積種植大蒜，是我國大蒜重要產區(qū)之一。由于大蒜為無性繁殖作物[4-6]，隨著種植年限的增加病毒病危害愈加嚴重，給黑龍江省大蒜產業(yè)的發(fā)展造成了嚴重影響。因此，建立快速、準確的分子檢測技術對于研究LYSV發(fā)生、分布與危害具有科學意義和實用價值。國外應用RTPCR方法進行大蒜病毒檢測較多，Takaki等從大蒜花葉病毒病葉上分離了LYSV的弱毒株系和強毒株系，克隆了基因組全序列，并比較其序列之間的差異[7]。目前，國內僅限于有關RT-PCR技術檢測大蒜病毒的報道[2,8]，但缺乏對病毒基因序列的分析。

本研究利用病毒特異性引物擴增了LYSV黑龍江分析物的CP基因，并與其他LYSV分離物進行了同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析，從基因水平上明確不同病原小種的進化關系，為LYSV黑龍江分離物的分子鑒定及其同種病毒不同分離物的遺傳進化研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大蒜病株采自黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)、寧安市、富錦縣、訥河縣等大蒜主產區(qū)，經電鏡觀察含有線狀病毒粒子。將應用Agdia公司生產的DASELISA病毒檢測試劑盒檢測為陽性的樣品，接種到LYSV的繁殖寄主韭蔥上，置于溫室中觀察發(fā)病情況，經DAS-ELISA法檢測病毒達到高峰期時采收，-80℃保存?zhèn)溆?。LYSV的陰、陽性對照由黑龍江省農業(yè)科學院植物脫毒苗木研究所提供。

大腸桿菌Escherichia coli GM109，由東北農業(yè)大學提供。pMD18-T（購自TaKaRa（大連）公司）；M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶、Eco RⅠ和SalⅠ（購自寶生物工程（大連）有限公司）；dNTP（購自北京鼎國生物技術有限公司）；B型質粒小樣快速提取試劑盒和B型小量DNA片段快速回收試劑盒（購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司）；引物合成及序列測定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 LYSV CP基因的克隆及序列測定

1.2.1 LYSV特異性引物的設計

根據GenBank中已報道的LYSV核苷酸序列，應用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計合成1對擴增LYSV CP基因全序列引物，其序列為：上游引物 LY-CP1：5'CCGAATTCATGTTTGAGTATCA AGCCGG 3'，下游引物LY-CP2：5'CCGTCGACTC ACTGCATATGCGCACCAT 3'。在上游引物中引入Eco RⅠ酶切位點，下游引物中引入SalⅠ酶切位點。

1.2.2 病毒總RNA的提取

參考侯義龍等的方法提取總RNA[9]，并稍有改動。取50 mg感病組織于1.5 mL Eppendorf管中，液氮中研磨，加入600 μL提取緩沖液（50 mmol·L-1pH 8.0 的 TrisCl、140 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1EDTA、1%SDS、2%PVP、10 U RNAsin、2%巰基乙醇，后兩種現(xiàn)用現(xiàn)加），離心去渣取上清。加入與上清液等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）溶液，混勻，離心取上清。加入與上清液等體積的氯仿∶異戊醇（24：1）溶液，混勻，離心取上清；加入上清液2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 mol·L-1的NaAc，混勻，-20℃放置3 h后，離心，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次。再用無水乙醇洗1次，真空干燥，溶于40 μL TE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR擴增

病毒RNA反轉錄體系：1.1 mmol·L-1dNTP、2.5 μL 5×Buffer、9.5 U RNasin、45.0 U RTase、2 μL 總 RNA、1.5 μmol·L-1引物，總體積為 10 μL。反轉錄程序：42℃1 h，95℃ 5 min，4℃5 min。RT-PCR反應體系：加入DNA模板4.0 μL、上下游引物各 22.0 ng、2.3 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1dNTP、1.0 U TaqDNA 聚合酶、2.3 μL 10×Buffer，總體積為25 μL。PCR反應程序：94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收目的DNA片段。

1.2.4 目的基因的克隆、序列測定與分析

PCR擴增產物純化后連接到pMD18-T載體上，CaCl2法轉化JM109大腸桿菌感受態(tài)細胞[10]。挑取抗性單菌落，擴繁后，應用B型質粒小樣快速提取試劑盒提取質粒，利用Eco RⅠ和SalⅠ對重組質粒進行酶切鑒定。目的片段委托上海生工生物工程有限公司進行測定，采用DNAman和DNAstar軟件進行序列分析。

2 結果與分析

2.1 LYSV CP基因的RT-PCR擴增

以感染LYSV的大蒜葉片總RNA為模板，利用LYSV病毒特異性引物LY-CP1和LY-CP2進行反轉錄和PCR擴增，得到一條特異片段，長度約為885 bp（見圖1），而陰性對照無此特異條帶。

圖1 LYSV的RT-PCR擴增結果Fig.1 Amplification result of LYSV by RT-PCR

2.2 LYSV CP基因克隆

為了進一步驗證所擴增的目的片段，將其克隆到pMD18-T載體后，提取質粒，并進行酶切鑒定。酶切產物的電泳結果顯示（見圖2），重組質粒利用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切，可獲得一條大小約885 bp的條帶，與預期的大小相同，表明外源片段已插入到載體中。

圖2 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.2 Digestion identification of recombined plasmids of LYSV by Eco R I and Sal I

2.3 LYSV CP基因的序列測定與分析

對重組質粒的插入片段進行序列測定，測序結果經DNAstar軟件分析，只含有一個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），其長度為 885 bp，可編碼295個氨基酸，其中A：295個、C：174個、G：225個、T：191個，G+C含量45.1%。將測得的序列與GenBank中查找來自不同國家和地區(qū)的其他LYSV分離物CP基因序列進行比較，結果表明，核苷酸序列同源性最高達88.6%，氨基酸序列同源性最高可達93.1%，證明成功擴增到LYSV黑龍江分離物HLJ的CP基因。GenBank登錄號為GU373816。

2.4 LYSV不同分離物CP核苷酸及氨基酸序列差異分析

將LYSV 24個不同分離物的CP核苷酸序列進行同源性比較（見表1），結果表明，測得的LYSV黑龍江分離物HLJ與已知其他不同分離物的CP核苷酸序列同源性為79.7%～88.6%，而24個不同分離物間CP核苷酸序列的同源性為75.1%～100%。根據CP核苷酸序列推導對應的氨基酸序列，對LYSV的24個不同分離物CP基因的氨基酸序列進行同源性比較分析，結果表明，測得的LYSV黑龍江分離物HLJ與已知其他不同分離物CP氨基酸序列同源性為83.7%～93.1%，而24個不同分離物間CP氨基酸序列的同源性為75.8%～100%（見表2）。依據LYSV CP氨基酸序列建立系統(tǒng)進化樹，可將LYSV不同分離物劃分為4個類群：LYSV黑龍江分離物HLJ屬于類群ⅳ，與南韓和巴西大蒜上的LYSV有較近的親緣關系，表現(xiàn)一定的寄主相關性（見圖3）。

圖3 24個LYSV分離物CP基因氨基酸序列遺傳進化Fig.3 Phylogenetic tree of coat protein amino acid sequence of 24 LYSV isolates

表1 24個參與序列比對的LYSV分離物來源Table 1 Origin of 24 LYSV isolates for sequences comparison

表2 2 4個LY SV 分離物CP 氨基酸序列比對結果T ab le 2 C om p a rison of co at p ro tein a m in o a cid seq u en ce o f 2 4 L Y S V iso lates 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1 3 14 15 1 6 17 18 1 9 2 0 21 2 2 2 3 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24注13.3 12.1 10.9 17.6 16.3 15.8 17.1 15.6 14.7 17.1 13.7 6.9 16.6 16.4 10.9 14.1 15.9 18.5 10.4 8.4 10.9 11.2 11上.0方8 7.5 1 2.1 2 2.7 1 6.7 1 9.3 1 8.8 1 9.3 1 8.6 1 6.0 2 0.2 0.3 1 6.6 2 0.6 2 0.0 9.6 1.4 1 5.8 2 0.7 9.5 1 0.3 8.4 9.8 1 1.4列8 9.2 8 8.5 1 9.2 1 5.8 1 9.8 1 8.9 2 0.3 1 5.2 1 1.4 2 1.2 1 2.5 1 5.0 2 0.3 1 4.7 3.9 1 2.5 1 5.4 2 0.3 7.5 9.8 3.1 3.9 7.4，89.8 80.5 84.4 20.7 24.8 23.7 25.4 24.1 22.5 26.5 23.2 4.0 23.7 23.0 18.2 23.2 22.8 25.4 17.4 14.8 19.3 18.2 20.3 8 3.7 8 5.1 8 5.8 8 1.6 1 9.3 2 0.7 2 1.2 2 1.4 1 8.7 2 0.3 1 7.1 1 7.6 2 3.0 2 1.0 1 4.5 1 8.0 1 0.4 2 1.3 1 6.2 1 2.8 1 4.5 1 4.8 1 5.3變8 5.1 8 3.0 8 2.3 7 8.9 8 2.6 1 1.2 1 1.6 1 7.3 2 0.0 2.1 1 9.7 1 8.8 1 2.0 1 7.7 1 9.2 1 9.3 1 9.3 5.4 1 6.6 8.4 1 9.2 1 9.6 1 9.7。85.8 83.4 83.0 79.7 81.6 89.6 1.8 16.0 18.6 10.8 18.4 17.9 5.8 16.0 17.3 19.3 20.7 12.5 16.2 6.6 16.8 17.7 19.2 84.4 83.0 81.9 78.5 81.3 89.3 98.3 16.4 19.1 11.2 18.8 19.3 5.4 16.4 18.3 19.7 21.6 12.9 17.1 7.5 17.8 18.7 20.6 8 5.7 8 3.6 8 5.3 7 9.3 8 0.8 8 4.6 8 5.3 8 5.3 4.7 1 7.7 1 9.1 1 8.6 1 6.4 3.6 1 5.2 1 9.1 2 1.0 1 8.2 1 6.4 2.6 1 5.2 1 5.5 1 4.5 86.4 85.7 88.5 80.5 82.9 82.5 83.2 83.2 95.5 20.4 16.4 17.7 19.1 6.2 12.0 16.4 18.2 21.0 13.1 5.2 11.1 12.2 11.5 84.4 82.4 81.3 77.7 81.9 97.9 90.0 89.6 83.9 82.2 20.6 20.2 11.6 18.2 19.7 21.1 21.2 5.4 17.6 8.9 19.7 20.1 20.6 8 7.2 9 9.7 8 7.8 8 0.1 8 4.4 8 2.7 8 3.7 8 3.4 8 3.2 8 5.3 8 2.0 1 7.1 2 0.2 2 0.4 1 0.1 1.8 1 6.3 2 1.2 9.9 1 0.8 8.8 1 0.3 1 1.8 93.1 85.1 87.5 96.1 84.0 83.4 84.1 83.0 83.6 84.3 82.4 84.8 19.6 17.6 14.1 17.1 18.9 19.8 13.0 9.8 14.5 14.3 15.2 84.8 82.0 81.9 79.7 79.9 88.9 94.5 94.8 85.3 83.2 89.3 82.4 82.4 17.2 17.8 21.1 22.1 12.9 17.1 8.4 17.3 17.7 18.7 8 4.7 8 2.2 8 5.4 8 0.1 8 0.8 8 4.0 8 5.0 8 5.0 9 6.5 9 4.1 8 3.6 8 1.9 8 4.3 8 4.3 1 5.2 2 0.4 2 1.4 1 8.2 1 6.4 2.1 1 5.2 1 5.5 1 5.8 90.6 90.6 96.2 75.8 86.8 83.1 84.6 83.8 82.7 85.3 82.7 90.2 87.6 84.2 85.0 10.9 14.5 18.7 8.4 10.8 4.7 0.0 7.1 86.9 98.6 88.2 80.1 83.7 83.0 83.0 82.7 82.9 85.0 81.7 98.3 84.8 81.7 81.5 89.5 16.3 20.7 9.5 11.3 9.6 11.2 12.7 8 5.1 8 5.8 8 6.1 8 0.1 9 0.3 8 3.0 8 1.9 8 1.3 8 1.5 8 3.6 8 1.3 8 5.4 8 3.0 8 0.9 8 0.8 8 6.8 8 5.4 2 0.8 1 5.3 1 3.3 1 4.4 1 4.8 1 5.3 83.7 81.9 82.3 78.5 81.3 94.8 88.5 88.2 83.6 81.5 94.8 81.6 82.6 88.2 82.9 83.8 81.9 80.9 16.6 9.4 19.2 19.1 22.0 90.3 91.1 92.6 78.9 85.1 85.1 85.5 84.8 82.2 84.8 84.4 90.7 88.1 84.8 82.2 92.1 91.1 85.5 85.5 10.3 8.8 8.5 9.1 9 2.1 9 0.4 9 0.8 7 5.7 8 8.3 9 2.1 9 3.7 9 2.9 9 7.5 9 5.0 9 1.6 9 0.0 9 0.8 9 2.1 9 7.9 9 0.0 8 9.5 8 7.9 9 1.2 9 0.4 1 0.8 1 1.1 9.4 91.0 91.4 97.0 78.1 86.8 83.1 85.0 84.2 82.3 85.7 82.7 91.0 88.0 84.6 84.6 95.5 90.6 87.2 83.5 92.1 90.0 4.8 6.7 90.4 90.4 96.2 75.8 86.6 82.8 84.3 83.5 82.4 85.1 82.4 90.0 87.4 84.3 84.7 1 00 89.7 86.6 83.5 92.0 87.9 95.4 7.2 8 9.8 8 9.4 9 2.3 8 1.6 8 5.9 8 2.7 8 3.1 8 2.0 8 5.9 8 8.4 8 2.0 8 9.1 8 6.3 8 3.5 8 4.9 9 2.9 8 8.4 8 5.6 8 1.0 9 1.4 9 1.2 9 3.2 9 2.7：右為序同源性左下方為序列異度N ote∶T h e aboveright part p resen ts sequ en ce sim ilarity,and low -left part presen ts sequ en ce diversity.

3 討論與結論

目前侵染大蒜的病毒主要有LYSV、大蒜普通潛隱病毒（Garlic common latent virus，GCLV）、洋蔥黃矮病毒（Onion yellow dwarf virus，OYDV）和青蔥潛隱病毒（Scallion latent virus，SLV）等，它們往往都是復合侵染大蒜，具有相似的特征，試驗寄主范圍較重疊，并且在感病寄主上表現(xiàn)相似的癥狀，所以，很難通過生物學方法對大蒜病毒進行分離與鑒定。

此外，大蒜病毒的傳播途徑、體外保毒期、稀釋限點、鈍化溫度、細胞質內含體形態(tài)等生物學指標也可作為病毒鑒定標準[11]，但這些方法耗時長，且鑒定有效性差。目前，血清學方法仍是鑒定大蒜病毒的常用方法，但已有研究表明，利用血清學技術進行病毒小種的鑒定時結果不可靠，同一屬內不同病毒間CP基因氨基酸序列同源性較高，抗血清常常會產生交叉反應，從而造成假陽性的出現(xiàn)，不能將這些病毒有效的區(qū)分開。

病毒的CP基因在寄主癥狀表現(xiàn)、寄主范圍、病毒的介體傳播等方面起著重要作用[12-13]。利用分子生物學方法鑒定植物病毒，可以通過病毒基因組結構和序列分析真實地闡明植物病毒種的分類[14-15]，明確了不同病毒小種的進化關系。

本研究克隆了LYSV黑龍江分離物（LYSVHLJ）的CP基因全長cDNA序列，序列分析表明，LYSV-HLJ與GenBank中其他不同分離物的CP核苷酸序列同源性為79.7%～88.6%，氨基酸序列同源性為83.7%～93.1%。可見，LYSV黑龍江分離物的序列變異較大。依據LYSV CP氨基酸序列建立系統(tǒng)進化樹，可將LYSV不同分離物劃分為4個類群，LYSV-HLJ與南韓和巴西大蒜上的LYSV有較近的親緣關系，同屬于ⅳ類，表現(xiàn)一定的寄主相關性。

黑龍江省是我國大蒜的重要產區(qū)之一，但近年大蒜病毒病的發(fā)生日益嚴重，尤其是LYSV發(fā)生比較普遍，且尚無有效的檢測方法。本研究通過對LYSV CP基因的序列分析，明確了侵染黑龍江大蒜病毒LYSV病原小種的進化關系，為該病毒的分子鑒定提供了理論依據，也為進一步擴增病毒的基因組全序列、了解LYSV的變異與環(huán)境之間的關系、致病性分化等奠定了基礎。

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