王 爽 ，楊 謙＊ ，孫 磊 ，王 允，Olivia Juba

（1.哈爾濱工業(yè)大學生命科學與工程系，哈爾濱 150001；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，哈爾濱 150086）

中度嗜鹽菌是一類能夠適應鹽濃度在3%～15%NaCl之間有最佳生長能力的極端微生物類群[1]。中度嗜鹽菌分布極其廣泛，在鹽湖、鹽堿湖、海洋、曬鹽池、鹽堿土壤以及海產(chǎn)品和一些鹽漬類食品中均有發(fā)現(xiàn)[2]。最早關于中度嗜鹽菌的研究是LeFever和Round對黃瓜發(fā)酵鹽水進行微生物學研究時[3]，在0～15%NaCl濃度范圍內(nèi)分離得到了一群無色細菌。第一個有效命名的中度嗜鹽菌是Vibrio costicola[4]。隨著中度嗜鹽菌分類工作的進展，許多相關的種被歸入相應的科和屬。中度嗜鹽菌自身擁有在高鹽環(huán)境生存的適應機制，也因其鹽耐受范圍寬，而能夠在鹽湖、鹽性土、沙漠、鹽礦、鹽田、鹽漬食物等多種不同的高鹽環(huán)境中生存。

我國北方存在大面積的鹽堿地，蘊藏著豐富的嗜鹽微生物資源，為開展嗜鹽菌的研究提供了得天獨厚的條件。試驗采集大慶市鹽堿地的20個鹽堿土樣，對其進行嗜鹽菌的分離、生物學特性的分析及系統(tǒng)發(fā)育地位的確定，從中篩選出潛在的新種。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2007年4月3日，于大慶市開發(fā)區(qū)公路附近、一營附近和黑龍江八一農(nóng)墾大學附近采集鹽堿土20份裝于無菌塑料袋中，密封，帶回實驗室于4℃保存。

1.2 菌株的分離及篩選

采用稀釋平板法將不同稀釋度的土壤混合樣品分別涂布于10%、15%和20%NaCl的改良S-G固體培養(yǎng)基上[5]，37℃培養(yǎng)3 d，挑取不同類型的單菌落反復劃線，直至獲得純種，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 形態(tài)觀察

將獲得的45株細菌接種于改良的S-G固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3 d，記錄菌落顏色及形態(tài)，同時進行革蘭氏染色，在油鏡（10×100）（OLYMPUS BX5-1）下觀察菌體形態(tài)。

1.4 生理生化特征測試

生理生化特征參照文獻[6]的方法，選擇了氧化酶、過氧化氫酶活性，產(chǎn)H2S，Tween、淀粉、明膠和酪素的水解試驗。

1.5 16Sr DNA基因序列擴增和系統(tǒng)進化分析

選擇有代表性的菌株進行16SrDNA基因序列擴增和系統(tǒng)進化分析。

1.5.1 菌體總DNA的提取

將菌株接種于改良的S-G液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以6 000 r·min-1離心收集菌體。細菌總DNA的提取采用傳統(tǒng)方法[7]。

1.5.2 16SrDNA的PCR擴增

以細菌總DNA為模板進行PCR擴增，正向引物Primer1（對應于E.coli的16S rDNA 5'端8～27f位置）：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；反向引物Primer2（對應于E.coli的16SrDNA 5'端1 522～1 541位置）：5'AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3'。PCR擴增條件：94℃預變性5 min，加Taq酶后94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，共30個循環(huán)，最后再72℃延伸7 min。

1.5.3 PCR產(chǎn)物的連接與轉化

用北京寶泰克生物技術有限公司的多功能DNA純化回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD18-T載體在16℃連接10 h，熱沖擊法轉化E.coli Top10感受態(tài)，37℃振蕩培養(yǎng)1 h后，涂在含有氨芐青霉素的LB平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，從平板上挑取菌落進行菌液PCR（反應條件與1.5.2相同）以篩選出陽性克隆。

1.5.4 16SrDNA序列分析及系統(tǒng)進化樹的構建

陽性轉化子制成菌液送上海Invitrogen生物技術有限公司測序。將測得的序列利用Blast軟件在GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，選取同源性較高的典型菌株的16SrDNA序列作為參比對象，然后用CLUSTAL W軟件進行多序列比對并計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性[8]，使用MEGA 3.1軟件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型和Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹[9]，1 000次隨機抽樣，計算Bootstrap值以評估系統(tǒng)進化樹的置信度。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學特征

混合土樣經(jīng)富集后，分別接種于含有10%、15%和20%NaCl的改良S-G固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，所獲得的大量菌落中其中40%為黃色，其余為乳白色；在乳白色菌落中，邊緣呈鋸齒狀且難挑取的菌落約占26%，其他均為光滑、邊緣整齊且易挑取的菌落。經(jīng)初篩后獲得45株分離株，G+與G-菌的比例為19：26（分別以枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為陽性和陰性對照）。根據(jù)菌落特征、細胞形態(tài)和革蘭氏染色反應的差異選擇其中的8株作為研究對象，菌株編號分別為X10-1，X10-2，X10-7，X1006，15-1，15-2，15-7和20-9，其細胞形態(tài)及培養(yǎng)特征見圖版Ⅰ和表1。8株中度嗜鹽菌全部為桿狀，菌株15-7的菌體較小，（0.5～0.7）μm×（1.4～1.6）μm，另7株大小為（0.6～0.8）μm×（3.8～4.2）μm。

圖版I 8株中度嗜鹽菌的顯微照片（標尺=5.0μm）Plate I Micrographs of eight strains moderately halophiles(Scale bar=5.0μm)

2.2 生理生化特征

部分生理生化試驗結果見表2。菌株X10-1與X10-7僅Tween20的水解能力不同，其他各項指標的結果均一致，這表明兩菌株在系統(tǒng)分類上親緣關系可能較相近；菌株X1006和15-1各生化指標的結果完全相同，而與20-9的大部分結果一致，只是它們分別為10%、15%和20%NaCl改良S-G培養(yǎng)基中的優(yōu)勢菌群，說明這三株菌在系統(tǒng)分類上親緣關系也比較相近，可能X1006與15-1即為不同培養(yǎng)基上獲得的同一菌株。

2.3 分離株16Sr DNA序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

8株中度嗜鹽菌進行16S rDNA全序列測定，獲得幾乎全長的16SrDNA序列（1 500 bp以上）。采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹，屬于Bacillaceae科的6株菌株的16SrDNA序列進化樹如圖1（A）所示，屬于Halomonadaceae科的2株菌株的16SrDNA序列進化樹如圖1（B）所示，節(jié)點的數(shù)字表示經(jīng)過1 000次Bootstrap分析得到的結果，標尺表示每100個核苷酸中有1個堿基替換。

采用Blast軟件將測得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株15-1、20-9和X1006與Bacillaceae科的Alkalibacillus屬處于同一分支上，并與親緣關系最近的成員Alkalibacillus haloalkaliphilus DSM 5271T相似性超過99%，因此，它們應為同一物種。菌株X10-1、X10-7和15-2與Bacillaceae科的Bacillus屬處于同一分支上，其中15-2與Bacillus agaradhaerens DSM 8721T的16S rDNA序列相似性為99.6%，它們應為同一物種；X10-1和X10-7的16SrDNA序列與Bacillus saliphilus DSM 15402T的相似性最高，達到97.8%，與Bacillus屬的其他成員相似性低于97%，而菌株X10-1和X10-7之間16SrDNA序列的的差異僅為0.13%，結合兩菌株表型特征和生理生化特征的數(shù)據(jù)，因此它們可能代表Bacillus屬的同一新種。菌株15-7和X10-2聚在Halomonadaceae科的Halomonas屬，它們與Halomonas pantelleriensis DSM9661T的序列相似性最高，分別為98.8%和98.7%，而與Halomonas屬的其他成員的相似性≤96%，它們可能為Halomonas屬下的新種；菌株15-7和X10-2之間16SrDNA序列的差異為0.58%，部分生化特征結果明顯不同，因此，兩菌株彼此之間的差異及與Halomonas pantelleriensis DSM9661T的親緣關系有待于通過更詳細的表型特征和DNA-DNA雜交試驗的進一步確定。

表1 細菌的形態(tài)及培養(yǎng)特征Table 1 Morphology and cultural characteristics of isolates

表2 8株中度嗜鹽菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of eight strains moderately halophiles

圖1 中度嗜鹽菌基于16Sr DNA序列的系統(tǒng)進化樹（A）和（B）Fig.1 Phylogenetic tree(A)and(B)base on the 16Sr DNA sequence of moderately halophilic bacteria

3 討論

中度嗜鹽菌對環(huán)境有極強的適應能力，在自然界中廣泛分布，是鹽生生態(tài)系統(tǒng)重要的組成之一。近年來，我國的科研人員幾乎每年都從國內(nèi)的不同鹽環(huán)境中分離出許多新的嗜鹽微生物類群并得到了國際學術界的承認。吳曉磊等在研究微生物有效降解石油污染物的過程中，從大慶油田的原油污染鹽土中分離到一株新的中度嗜鹽菌，并將其命名為Halomonas daqingensis sp.nov.[11]，除此之外，還沒有來自該地區(qū)的其他嗜鹽菌新分類群的相關報導。因此，調(diào)查該地區(qū)嗜鹽微生物的多樣性，并盡可能多的分離、獲得和保藏菌株，可為大慶鹽堿地微生態(tài)學的研究奠定基礎，也將為嗜鹽菌的應用研究提供材料來源和信息。

使用分子生物學方法研究微生物在環(huán)境中的多樣性已在多種極端環(huán)境中展開，這些方法基本上都是利用PCR擴增來獲得環(huán)境中微生物區(qū)系的16S rDNA的信息，然后進行系統(tǒng)分類學研究[10]。本研究測定的嗜鹽菌16SrDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的比對結果表明，大慶鹽堿土中蘊藏著豐富的嗜鹽微生物資源，目前所獲得的中度嗜鹽菌菌株分布在Alkalibacillus、Bacillus和Halomonas三個屬，可能由于采用的分離培養(yǎng)基較單一，大大限制了可培養(yǎng)微生物的種類。在今后的研究工作中可嘗試采用不同的培養(yǎng)基進行分離篩選，并結合詳細的表型特征、化學分類特征以及與模式種的分子雜交等數(shù)據(jù)的分析來確定分離株的分類地位。

4 結論

本文采用傳統(tǒng)的微生物分離純化技術、顯微觀察、生理生化特性分析與分子生物學相結合的方法對大慶鹽堿土中的中度嗜鹽細菌進行分類學研究。在所分析的8株中度嗜鹽菌菌株中，菌株X1006、15-1和20-9屬于Alkalibacillus屬，且與已知種具有較高的同源性；菌株X10-1、X10-7和15-2屬于Bacillus屬，其中X10-1（或X10-7）可能為一新種；而菌株X10-2和15-7為Halomonas屬的成員，與已知種Halomonas pantelleriensis DSM9661T的16SrDNA相似性可將分離株考慮為Halomonas屬的新種。各菌株分類學地位的最終確定將在今后的研究工作中完成。

[1]Ventosa A,Nieto JJ,Oren A.Biologyof moderatelyhalophilic aerobic bacteria[J].JMicrobiologyand Molecular Biology Reviews,1998,62:504-544.

[2]趙百鎖,楊禮富,宋蕾,等.中度嗜鹽菌在生物技術中的應用[J].微生物學通報,2007,34(2):359-362.

[3]Le Fevre E,Round L A.A preliminary report upon somehalophilic bacteria[J].JBacteriol,1919(4):177-182.

[4]Smith F B.An investigation of a taint in rib bones of bacon.The determination of halophilic vibrios[J].Proc R Soc Queens,1983,49:29-52.

[5]田新玉,徐毅,劉洪燦,等.嗜鹽嗜堿桿菌屬的一個新種[J].微生物學報,1997,37(1):1-6.

[6]東秀珠,蔡妙芬.常用細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[7]Marmur J.A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid frommicroorganisms[J].JMol Biol,1961(3):208-218.

[8]Thompson JD,Higgins DG,Gibson T J.CLUSTAL_W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice[J].Nucleic Acids Res,1994,22:4673-4680.

[9]Kumar S,Tamura K,Nei M.MEGA3:integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J].Brief Bioinform,2004(5):150-163.

[10]任培根,周培瑾.中度嗜鹽菌的研究進展[J].微生物學報,2003,43(3):427-431.

[11]Wu G,Wu X Q,Wang Y N,et al.Halomonasdaqingensis sp.nov.,a moderately halophilic bacteriumisolated froman oilfield soil[J].Int JSyst Evol Microbiol,2008,58:2859-2865.