薛東升，王國(guó)明

（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201418）

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿的地上干燥部分，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效，用于治療高血壓、冠心病、骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、陽(yáng)痿、半身不遂、四肢麻木等。藥理研究表明，淫羊藿能增加冠脈血流量，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進(jìn)DNA合成率，影響核酸代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和骨胳生長(zhǎng)，提高心腦血管活性；其主要有效成分是淫羊藿總黃酮，以淫羊藿苷為主[1－2]。對(duì)于淫羊藿總黃酮的提取分離工藝研究，文獻(xiàn)多有報(bào)道[3－5]，但對(duì)不同分離、純化工藝的比較研究鮮有報(bào)道。筆者對(duì)AB－8大孔吸附樹脂吸附、乙酸乙酯萃取和酸堿沉淀3種分離純化方法進(jìn)行了比較研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－10A型高效液相色譜儀，SPD－10AVP紫外可見檢測(cè)器，EastChrom G02色譜工作站；Cary50型紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安）；AG135型十萬(wàn)分之一電子天平（Mettlet Toledo）。淫羊藿藥材（經(jīng)鑒定為巫山淫羊藿 Epimedium wushanense T.S.Ying，購(gòu)自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆灰蜣杰諏?duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為0737－200111，供含量測(cè)定用）；AB－8大孔吸附樹脂（南開大學(xué)化工廠）；乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher），水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿提取液制備

取淫羊藿9 kg，依次加10倍量、8倍量水煎煮2次，每次1h，濾過，合并兩次煎液，減壓濃縮至9 000mL，放涼，加乙醇使含醇量達(dá)70％，靜置，濾過，濾液回收乙醇，減壓濃縮至9 000mL，高速離心，取上清液，平均分為9份。

2.2 分離純化工藝

2.2.1 AB－8大孔吸附樹脂吸附法

取提取液3份，分別調(diào)pH至5.0，通過已處理好的AB－8大孔吸附樹脂柱（6 cm×50 cm），上樣速度為1 BV/h，以水洗至流出液無(wú)色，棄去水洗液，再以70％乙醇洗脫，洗脫速度為2.5 BV/h，收集70％乙醇洗脫液5 000mL，減壓回收乙醇，濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，計(jì)算干膏得率。檢測(cè)干膏中總黃酮和淫羊藿苷的含量。

2.2.2 乙酸乙酯萃取法

取提取液3份，分別用3倍量的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液，減壓回收乙酸乙酯，濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，計(jì)算干膏得率。檢測(cè)干膏中總黃酮和淫羊藿苷的含量。

2.2.3 酸堿沉淀法

取提取液3份，分別濃縮至稠膏（d=1.15，60℃），用 5％ NaOH溶液調(diào)pH至8.5，60℃保溫1h，趁熱濾過，濾液加鹽酸調(diào)pH至2.0，放冷，過濾，取析出的沉淀真空干燥，得干膏，稱重，計(jì)算干膏得率。檢測(cè)干膏中總黃酮和淫羊藿苷的含量。

2.3 淫羊藿總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 溶液制備

精密稱取干燥至恒重的淫羊藿苷對(duì)照品，用甲醇溶解，制成1 g/L的對(duì)照品溶液。精密稱取干燥至恒重的提取物0.15 g，用甲醇溶于100mL量瓶中，超聲15min，放置冷卻，定容；精密吸取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至該度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.2 最大吸收波長(zhǎng)確定

分別精密量取對(duì)照品和供試品溶液1mL，各置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用紫外可見分光光度計(jì)于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得紫外吸收光譜。結(jié)果表明，供試品最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，與淫羊藿苷對(duì)照品完全一致，故采用270 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL，置100mL量瓶中，加甲醇定容至100mL，搖勻，照分光光度法，以甲醇為空白，在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（X）對(duì)質(zhì)量濃度（Y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=22.374X+0.086 7，r=0.999 4（n=5）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在5～25μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液1mL，共6份，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度。結(jié)果的 RSD=1.02％（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液1mL，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法操作，于制備樣品后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果的 RSD=0.38％（n=6），表明供試品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品6份，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作。結(jié)果的 RSD=1.73％（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（79.43％）75mg，共6份，分別用甲醇溶于100mL量瓶中，超聲15min，定容；精密吸取1 mL，置100 mL量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液（0.108 g/L）4，6，8mL，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 淫羊藿總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

精密稱取提取物，依法制備供試品溶液，精密量取1mL，同線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，按回歸方程計(jì)算含量。

2.4 淫羊藿苷含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－水（30∶70）；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)以淫羊藿苷計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

2.4.2 溶液制備

精密稱取干燥至恒重的淫羊藿苷對(duì)照品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.108 g/L的溶液，作為對(duì)照品溶液。取提取物25mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10min，放冷，再加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取供試品及對(duì)照品溶液適量，按擬訂的色譜條件測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，與對(duì)照品溶液色譜有相同保留時(shí)間的色譜峰（圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品4mg，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，使每1mL含淫羊藿苷0.16mg。分別精密量取以上對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，依次進(jìn)樣10μL，以淫羊藿苷進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=4 762.5X+108.1，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在32～160μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取0.108 g/L的淫羊藿苷對(duì)照品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD=0.76％（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取供試品溶液，于1，2，4，8，12，24h時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果的 RSD=2.02％（n=6），表明24h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果含量的 RSD=1.26％（n=6），表明方法重現(xiàn)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（46.58％）12.5mg，共6份，分別用甲醇溶于10mL量瓶中，超聲10min，定容；精密吸取1mL，置10mL量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液（0.108 g/L）4，6，8mL，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，依法測(cè)定含量。結(jié)果見表2。

表2 淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.4 樣品含量測(cè)定

精密稱取提取物樣品25mg，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液（0.108 g/L）和供試品溶液各10μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算淫羊藿苷的含量。

2.5 3種方法比較

計(jì)算不同分離純化方法所得到的干膏得率、總黃酮的含量和淫羊藿苷的含量。結(jié)果見表3。

表3 3種方法所得干膏得率、總黃酮含量和淫羊藿苷含量（±s，％）

表3 3種方法所得干膏得率、總黃酮含量和淫羊藿苷含量（±s，％）

分離純化方法AB－8大孔吸附樹脂吸附法乙酸乙酯萃取法酸堿沉淀法干膏得率5.23±0.21 3.83±0.14 4.16±0.20總黃酮含量80.35±2.80 58.41±3.04 63.38±2.20淫羊藿苷含量46.24±1.12 28.15±1.38 32.77±0.97

3 討論

考察結(jié)果表明，以AB－8大孔吸附樹脂吸附法最理想，其次為酸堿沉淀法，而乙酸乙酯萃取法較差。本研究中淫羊藿最佳分離純化工藝運(yùn)用了大孔吸附樹脂吸附法，顯著提高了提取物中總黃酮和淫羊藿苷的含量，對(duì)改進(jìn)中藥分離純化工藝有一定意義。同時(shí)，該工藝穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

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