張正平,孫 勇,張正慧,孫啟峰

(1.山東省萊蕪市高莊醫(yī)院,山東萊蕪 271100;2.山東省萊蕪市人民醫(yī)院,山東萊蕪 271100;3.山東省萊蕪市牛泉醫(yī)院,山東萊蕪 271100)

腫瘤的化療是其綜合治療的一個重要方面,而多藥耐藥(MDR)的影響是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。國內(nèi)外對逆轉(zhuǎn)MDR也進行了很多研究工作,在各種引起MDR的機制中,以P糖蛋白(PgP)介導(dǎo)的 MDR占重要方面,針對逆轉(zhuǎn)PgP介導(dǎo)的MDR的研究也較多,主要包括化學逆轉(zhuǎn)劑、單克隆抗體和基因水平調(diào)控等方面,本文是對PgP介導(dǎo)的 MDR的逆轉(zhuǎn)的研究進展做一個簡要綜述。

所謂MDR系指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時,對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機制不同的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉抗藥性,它是一種獨特的廣譜耐藥現(xiàn)象[1],PgP是一種ATP依賴性的跨膜外流泵,可將細胞內(nèi)化療藥物排出細胞外,從而導(dǎo)致腫瘤細胞內(nèi)化療藥物的蓄積濃度降低而不能有效殺死腫瘤細胞,從而導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥。幾乎所有人類腫瘤細胞均有不同程度的PgP表達,但是對化療不敏感或療效差的腫瘤往往有較高的PgP表達水平[2],目前對PgP介導(dǎo)的MDR的逆轉(zhuǎn)的研究主要從以下幾個方面進行。

1 化學逆轉(zhuǎn)劑

1.1 鈣離子通道阻滯劑和鈣調(diào)素抑制劑：鈣離子通道阻滯劑是最早發(fā)現(xiàn)具有逆轉(zhuǎn)MDR作用的藥物,主要有Verapamil(VER)及其衍生物、雙氫吡啶類化合物以及硫氮卓酮等。研究表明,鈣離子通道阻滯劑在 mdrl基因的翻譯水平上抑制Pgp的合成及活性,增加腫瘤細胞內(nèi)的化療藥物濃度,克服腫瘤細胞的耐藥性,提高化療效果。但由于這些藥物對心血管系統(tǒng)有 -定毒性,所以限制了它們在臨床上的應(yīng)用。Micktsch等報告在 VER的衍生物中 R-ver和 nor-VER具有鈣離子通道阻滯作用很小,同時又具有較低的細胞毒性和較高的逆轉(zhuǎn)能力的特性,故 R-ver和 nor-VER最有希望用于臨床。具有MDR逆轉(zhuǎn)作用的鈣調(diào)素抑制劑主要包括三氟拉嗦、三氟丙嗦、氯丙嗦、氟奮乃靜等吩噻嗪類化合物,其作用機制與鈣離子通道阻滯劑相似。

1.2 免疫抑制劑環(huán)孢霉素 A(Cs A)及其類似物：無免疫抑制作用的 CsA衍生物 SDZ PSC833在體內(nèi)外均能夠逆轉(zhuǎn)MDR 1基因的表達,阻止MDR克隆的形成,國外已將該藥用于難治性白血病和實體瘤的臨床研究[3,4];還有報道環(huán)孢霉素A及其衍生物 PSC 833可以明顯改變抗腫瘤藥物的藥代動力學,使血藥水平提高、減慢藥物的體內(nèi)代謝[5],而PSC833的逆轉(zhuǎn)作用是環(huán)孢霉素 A的 5～10倍,且無環(huán)孢霉素A的免疫抑制作用和腎毒性,目前已進人臨床試驗。

1.3 抗激素類化合物：雌激素非完全拮抗劑三苯氧胺(Tamoxifen)作為 MDR逆轉(zhuǎn)劑已用于臨床。Kirk等在對 5種新的抗雌激素衍生物的逆轉(zhuǎn)耐藥效果的研究中發(fā)現(xiàn),雌激素完全拮抗劑ICⅡ64的逆轉(zhuǎn)效果更好,它使阿霉素和長春新堿對MDR細胞 MCF-7/adr的毒性分別增加 25,35倍。ICⅡ64能完全逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染了 mdrl基因的肺癌細胞 Sl/1.1對長春新堿的耐藥,阻斷 Pgp對長春新堿的泵出?？乖型衔?RU486是孕酮化合物的衍生物。RU 486在低濃度((1μmol/L)時就可以有效抑制小鼠 Pgp的泵出功能,增加化療藥物蓄積,對人的 Pgp也有同樣的效果。有人認為,RU486結(jié)構(gòu)中的 1位(β-dimethylaminophenyl)取代基對于其拮抗劑Pgp功能發(fā)揮起到了重要作用,可見類固醇衍生物也是一類可以抑制Pgp泵出的逆轉(zhuǎn)劑。

1.4 蛋白激酶抑制劑：蛋白激酶(PKC)可以改變藥物在MDR細胞中的蓄積,在一些 MDR的腫瘤細胞 P KC的活性增加,推測抑制 P KC的活性可以對抗 MDR的發(fā)生。CGP41251是高度選擇性的PKC抑制劑,具有抗腫瘤作用及有效的耐藥逆轉(zhuǎn)作用,它可使 3種 MDR細胞系對阿霉素和長春新堿的敏感性增加。Pgp是一個 ATP依賴的“藥泵”,CGP41251可能是直接與 Pgp競爭 ATP或通過競爭 Pgp上的藥物結(jié)合位點,從而阻斷了Pgp的泵出功能,達到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用.目前,對 CGP41251逆轉(zhuǎn)機制尚不清楚,需進一步研究。KT-5720是另 -具有逆轉(zhuǎn)MDR的蛋白激酶抑制劑,在非毒性的濃度下可有效增加耐藥細胞 KB-V1、HU-1對化療藥物的敏感性,其抗耐藥機制尚不清楚。

1.5 表面活性劑：表面活性劑如吐溫 80,gremophorEL以及solutol HS15等被證明可以逆轉(zhuǎn) MDR,CRL1337是一種ethoxylated oleicacid制劑,它比 solutol和 gremophor表現(xiàn)出更高的耐藥逆轉(zhuǎn)活性。

1.6 多芳基取代咪唑類化合物：阮繼武等人用設(shè)計并合成了幾個新的多芳基取代咪唑類化合物(I一V),并選擇了兩種腫瘤耐藥細胞株KBV和 M CF-7/adr,采用MTT法測定了其對由 P-gP介導(dǎo)的MDR的逆轉(zhuǎn)效果.結(jié)果表明,化合物II和III具有很好的體外逆轉(zhuǎn) M DR活性(已申請專利保護[6]。

1.7 其他：除上面幾種主要的逆轉(zhuǎn)劑以外,5-溴甲苯[7],FK 506以及其結(jié)構(gòu)類似物Rapamycin,新的哇琳化合物MS-209,精胺聚合物 Poly-SPM.(polymeric conjugate of spermine),十字花科蔬菜中富含的代謝產(chǎn)物Indole-Carbinol(13 C),還有一些化合物也具有MDR的逆轉(zhuǎn)作用。

2 單克隆抗體

單克隆抗體是采用耐藥細胞或耐藥細胞膜蛋白作為抗原而制備的,可特異性識別、結(jié)合Pgp的胞膜外部分,從而逆轉(zhuǎn) MDR 1表型。將藥物與單抗相連,借助抗原-抗體的生物特異識別機制,可實現(xiàn)藥物的主動靶向。脂質(zhì)體表面交聯(lián)單克隆抗體制成的免疫脂質(zhì)體可滿足多種實際需要.抗 PgP的單抗能夠抑制MDR細胞對PgP底物的外排,增加PgP運輸藥物的細胞毒性。實驗證明,CD19的單克隆抗體可以抑止CD19和 PgP的相互作用,可導(dǎo)致淋巴瘤的 MDR逆轉(zhuǎn)[8]。單克隆抗體FC-2.15能夠識別腫瘤細胞膜表面的糖類抗原表面決定簇,并能夠連接白細胞表面糖蛋白,然后通過補體介導(dǎo)的細胞毒性作用溶解細胞。FC-2.15可在補體的作用下明顯提高人類乳腺癌細胞對阿霉素和紫杉醇的敏感性[9]。應(yīng)用 PgP的單克隆抗體MRK-16可以封閉 PgP的離子通道,從而阻止細胞化療藥物的外流,充分發(fā)揮化療藥物細胞毒性作用。在小細胞肺癌的動物模型實驗中,應(yīng)用 MRK-16單克隆抗體可以抑制SCID大鼠細胞的耐藥性和遠處轉(zhuǎn)移,同時提高大鼠的生存率[10]。這可能因為抗體不僅可以直接針對原位腫瘤細胞的PgP產(chǎn)生抗性,而且可以進入血液循環(huán)對轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞發(fā)揮細胞毒性作用。

3 基因水平調(diào)控

近年來,國內(nèi)外開始將反義技術(shù)應(yīng)用于腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究。根據(jù)堿基互補原理,設(shè)計出能特異地同相應(yīng)靶基因結(jié)合的RNA或DNA,影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,以達到特異抑制靶基因表達的基因調(diào)控技術(shù),包括反義 RNA(AntisenseRNA)技術(shù),反義 DNA(Antisense DNA)技術(shù),又稱反義寡核苷酸(Antisense oligodoxynucleotide,ASODN)技術(shù)、核酶(Ribozyme)技術(shù)。

3.1 MDR1基因的反義寡核苷酸(ODN)：MDR 1基因為一個較小的基因家族,雖然其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程尚不十分清楚,但已有研究證實其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)部位在MDRl基因 5'端上游非編碼區(qū)內(nèi),設(shè)計這段反義基因,發(fā)現(xiàn)能使耐藥的腫瘤細胞得到逆轉(zhuǎn)。李惠芳等利用互補于MDR 1基因5'末端轉(zhuǎn)錄起始部位的ODN直接轉(zhuǎn)染表達MDR 1基因的耐藥細胞株KB-8-5后,細胞內(nèi) Pgp表達水平下降,為弱陽性,細胞內(nèi)柔紅霉素(DNR)濃度提高,被轉(zhuǎn)染細胞對藥物的LC50由原來藥物敏感株的 5.6倍降為 3.2倍。以上結(jié)果說明 ODN逆轉(zhuǎn)了PgP介導(dǎo)的藥物耐受性,但逆轉(zhuǎn)作用不完全.作者分析其原因之一為ODN的降解問題.為此,作者以脂質(zhì)體 Lipofectin作為轉(zhuǎn)基因載體,使 ODN的耐藥逆轉(zhuǎn)作用有所提高,被轉(zhuǎn)染細胞對DNR的 LC50由原來藥物敏感株的 5.6倍降為 2.5倍,提示脂質(zhì)體可作為引導(dǎo) ODN靶向治療的方式之一,另有作者則認為對核酸上的氧原子進行硫代化、甲基化或用脂質(zhì)體進行包裹等方法在提高細胞攝入ODN的同時,一方面增加了細胞毒性,同時也降低了核酸反義抑制的效應(yīng).將低相對分子質(zhì)量的聚乙二醇(PEG)連接在 ODN的 5'的末端,結(jié)果顯示,細胞內(nèi) ODN攝入率明顯增加,高于其他修飾方法,且不影響細胞的生長特性,說明 ODN的 5'末端連接PEG在反義治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 MDR1基因的反義 RNA：ODN的作用是封閉 MDR 1基因而影響基因的轉(zhuǎn)錄,反義RNA則是與MDR 1基因的 mRNA形成二聚體而抑制 mRNA的翻譯。曹江等利用高表達反義MDR1-RNA重組質(zhì)粒 pRMAS轉(zhuǎn)染耐藥細胞 K562/Dox后,其 P-糖蛋白近乎陰性,細胞內(nèi)柔紅霉素濃度與敏感細胞系K 562幾乎一致,說明 P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排幾乎完全被抑制,顯示將反義 RNA的模板DNA導(dǎo)入細胞內(nèi),可產(chǎn)生大量反義RNA抑制 MDR1基因表達。資料還顯示,細胞除對阿霉素的耐受性完全被逆轉(zhuǎn)外,對長春新堿(VCR)和柔紅霉素(DNR)的耐受性仍保留 9.0倍和 14.1倍以上,說明 PgP表達轉(zhuǎn)陰后,MDR并不能完全逆轉(zhuǎn),提示還有其他機制作用于細胞的MDR。最近,Nieth等報道應(yīng)用反義RNA技術(shù)抑制胰腺癌細胞株 EPP85-181RDB和腸癌細胞株EPG 85-257RDB中MDR1基因的 91%的表達,兩種細胞對化療藥物柔紅霉素的耐藥性分別降低到 89%和58%,該研究表明特異性阻斷針對PgP依賴的 MDR基因表達可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性[11]。

3.3 切割MDR 1mRNA的核酶：核酶(Ribazyme)是正常存在于細胞內(nèi)并調(diào)控基因表達的RNA,是一類具有 RNA限制性內(nèi)切酶活性的小分子RNA,它特異地與靶 RNA的特定位點結(jié)合,識別 RNA序列的 GUN X為 A,C,G)序列并進行切割阻斷目的基因表達,其模型特征具有錘頭結(jié)構(gòu)(Hammerhead)、發(fā)夾狀,其結(jié)構(gòu)相對簡單,可以降解 m RNA,因此也稱為“分子剪刀”。Kobayashi等[12]合成兩個核酶基因,分別切割MDRImRNA 196位和 179位密碼子,將切割 MDRl m RNA 196位密碼子的核酶構(gòu)建于pHβAPrlneo載體上,電穿孔法導(dǎo)入到耐藥的人急性淋巴母細胞白血病細胞系 MOLT3/TMQ800中,轉(zhuǎn)染核酶后 MOLT3/TMQ 800對 VCR的耐藥性由原來的 700倍(與其母細胞 MOLT3比較)下降至 20～30倍。在耐藥的胰腺癌細胞系應(yīng)用核酶逆轉(zhuǎn) MDR,耐藥性更是由原來的 1600倍下降至 5.3倍。

目前通過細胞內(nèi)注射法、電穿孔法、氯化鈣、脂質(zhì)體介導(dǎo)法進行外源性導(dǎo)入,但在導(dǎo)入細胞過程中極易被核酶降解。用化學方法對核酶加以修飾,可以提高其抵抗核酸酶的能力,但其生物活性明顯減弱。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒的內(nèi)源性導(dǎo)入,有病毒滴度低、只能逆轉(zhuǎn)分裂期細胞、細胞內(nèi)表達率低和潛在致癌性等缺點。Lieber等應(yīng)用腺病毒載體將核酶基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi),證實了核酶基因在完整器官內(nèi)可以有效表達并發(fā)揮其切割活性。

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