丁 軻,余祖華,張春杰,程相朝,劉一塵,王 臣

(河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471003)

0 前言

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的急性、高度接觸性傳染病,不僅可致青、幼年雞較高的死亡率,而且導致嚴重的免疫抑制和免疫接種失敗,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。IBDV屬于雙RNA病毒科的禽雙RNA病毒屬,基因組中VP2和VP3是病毒的主要結構蛋白,共同構成病毒衣殼,是主要的宿主保護性抗原,而 VP2基因較為保守,且其蛋白具有血清型特異性位點,并能誘導產(chǎn)生抗病毒的血清中和抗體[3-4],是重要的免疫原基因。白細胞介素2(IL-2)是T淋巴細胞分泌的一種淋巴因子,可促進T細胞、B細胞的增殖和分化并可增強單核細胞以及NK細胞的殺傷活性,在免疫反應過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5-6]。IBD VP2基因不含信號肽序列,因而不能從轉(zhuǎn)染細胞中自主分泌,故不能有效活化B細胞和Th細胞。白細胞介素-2(lL-2)信號肽是有20多個氨基酸組成的高度疏水性序列,基于信號肽可介導蛋白質(zhì)分泌及可在不同蛋白質(zhì)互通使用的特點[7],本文用重疊延伸PCR技術(SOE-PCR)將lL-2基因與具有地方特色的IBDV野毒株的VP2基因進行融合拼接,并將所獲得的融合基因克隆至真核表達載體pc ICZαA中,并轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris X-33),以期利用真核表達具有天然活性的IL-2蛋白來輔助增強IBDV VP2蛋白的免疫原性。為進一步提高IBDV基因疫苗的免疫效果,開發(fā)新型IBDV疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)載體及菌株。pMD18-T-VP2、pMD18-T-IL2、pBluescprit SK+(pBSSK+)、大腸桿菌宿主菌JM109由河南科技大學動物科技學院禽病研究中心構建及保存;Pichia Pastoris X-33及其表達載體pPICZαA由南京農(nóng)業(yè)大學陳傅言教授惠贈。

(2)主要試劑。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司;dNTP、Taq Plus DNA聚合酶、DNA純化試劑盒購自上海生物工程有限公司;Zeocin抗生素購自Invitrogen公司;葡萄糖、山梨醇、生物素、YNB等購自OXOID公司;四甲基乙烯二胺(TMED)購自Promega公司;辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG購自北京博奧森生物技術有限公司。引物合成和測序由大連寶生物有限公司完成。

1.2 方法

(1)融合基因PCR引物設計。為了擴增IL2-VP2融合基因,共設計了2對引物:引物P1含有IL-2信號肽起始密碼子ATG,優(yōu)化序列上游引入了KpnI酶切位點;引物P2去除了IL-2的終止密碼子TAA,加上了中間接頭(Linker)。中間接頭(Linker)為高親水性氨基酸(Gly-Gly-Gly-Ser)編碼基因GGC GGA GGG TCT;引物P3去除了VP2基因的ATG起始密碼子,由中間接頭和一段VP2基因序列所構成;引物P4為擴增VP2全基因的下游引物,5,端加入了NotI酶切位點(見表1)。

表1 PCR引物序列

(2)重組表達質(zhì)粒pPICZαAIL2-VP2的構建。分別以pMD18-T-IL2、pMD18-T-VP2為模板擴增得到IL2-Linker片段和Linker-VP2片段,再以lL2-Linker和Linker-VP2兩個PCR純化產(chǎn)物的混合物為二次 PCR擴增模板, P1、P4分別為上、下游引物,PCR擴增獲得 lL2-VP2融合基因片段,將lL2-VP2融合基因片段回收純化后再與pMD18-T載體進行連接,獲得陽性克隆質(zhì)粒pMD18T-lL2-VP2,序列測定后將pMD18T-lL2-VP2和pPICZαA分別用KpnI和NotI雙酶切,電泳后回收、連接、轉(zhuǎn)化,獲得陽性重組表達質(zhì)粒pPICZαA-IL2-VP2。

(3)重組表達載體的線性化處理、電擊轉(zhuǎn)化及篩選。將構建的重組表達pPICZαA-IL2-VP2質(zhì)粒用Sac I酶切線性化(同時做空質(zhì)粒對照)后用Bio-rad電擊儀進行電擊轉(zhuǎn)化,參數(shù)為電壓1 500 V,電容25 μF,電阻200Ω,電擊時間為5 ms,電擊完畢后,立即加入 1 mL冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻,轉(zhuǎn)至1.5m L的EP管中,將菌體懸液涂布于YPDZ平板上后置于30℃培養(yǎng)34 d,將獲得的轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定后進行高抗性陽性轉(zhuǎn)化子的篩選,獲得陽性單克隆X-33/pPICZαA-IL2-VP2。

(4)重組畢赤酵母的誘導表達檢測和Western blot分析。挑取陽性單克隆X-33/pPICZαA-IL2-VP2,接種至BMGY中,30℃搖至對數(shù)期,收集菌體,用等體積BMMY重懸細胞,進行誘導表達,每24 h加甲醇至終濃度為1%繼續(xù)誘導。分別在0 h(0 d)、24 h(1 d)、48 h(2 d)、72 h(3 d)、96 h(4 d)的各個時間點收集上清進行SDS-PAGE分析表達水平及確定誘導最佳時間。表達上清液用硫酸銨沉淀濃縮,以PBS透析24 h,然后進行Western blot分析,用IBDV陽性血清作為一抗,辣根過氧化物酶標記羊抗雞IgG為二抗,DAB顯色,至目的條帶清晰時終止反應。

2 結果與分析

2.1 lL2-Linker的初次PCR結果

以含有IL-2 cDNA的pMD18T-lL2質(zhì)粒為模板,利用引物P1和P2進行PCR擴增出缺失了終止密碼子和在3,端引入了重疊引物的lL-2基因片段,1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示在大小約450 bp位置處可見清晰的特異性擴增條帶,與預期大小相符(見圖1)。

2.2 IBDV的Linker-VP2初次PCR結果

以pMD18T-VP2質(zhì)粒為模板,用重疊引物P3和P4進行PCR擴增后,在VP2的5,端引入了重疊延伸引物全序列。擴增出獲得了缺失VP2基因起始密碼子的1 400 bp左右的片段,與預期大小相符(如圖2所示)。

2.3 IL2-VP2融合基因的PCR結果

以兩個初次PCR產(chǎn)物的混合物為模板,通過重疊延伸PCR將IL-2基因和VP2基因進行前后拼接,擴增后獲得大小約為1.85 kb的片段,與預期大小一致,初步確定為IL2-VP2融合基因片段(如圖3所示)。

2.4 融合基因的T載體克隆和鑒定

將經(jīng)過初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pMD-lL2-VP2進行序列測定,結果顯示pMD-lL2-VP2的插入片段無移碼突變和堿基錯配,pMD-IL2-VP2中包含了lL-2 cDNA的起始密碼子ATG、VP2基因的終止密碼子TAA和人工接頭Linker在內(nèi)的插入片段完全正確。

2.5 pPICZαA-IL2-VP2真核表達載體的構建結果

將構建成的pPICZαA-IL2-VP2進一步用KpnI、NotI雙酶切pPICZαA-IL2-VP2重組質(zhì)粒,可以獲得3.6 kb和1.2 Kb左右 2個片段(如圖4所示),與預期大小相符;以pPICZαA-IL2-VP2為模板,P1和P4分別為上、下游引物,經(jīng)PCR擴增可以得到1.2 kb左右的特異性條帶,表明lL2-VP2基因已經(jīng)成功地連接到pPICZαA真核表達載體中。

圖3 IL2-VP 2融合基因PCR擴增結果

2.6 重組質(zhì)粒pPICZαA-IL2-VP2酵母菌X-33的轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

重組質(zhì)粒pPICZαA-IL2-VP2及pPICZαA空載體的線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33中,挑取在高抗性YPDZ(Zeocin 2 000μg/m L)的單個菌落抽提DNA基因組,以α-factor primer和3′-AOX1 primer為引物進行PCR檢測,篩選到含有目的基因片段的重組子(見圖5)。若IL2-VP2與酵母成功重組則應擴增出約1.41 kb(1.206 kb+195 bp)的片段,若未重組則只能擴增出195 bp的小片段,從圖5可見重組成功。

2.7 重組X-33/pPICZαA-IL2-VP2的誘導表達、SDS-PAGE及Western blot分析

X-33/pPICZαA-IL2-VP2陽性克隆及X-33/pPICZαA對照菌,用1%甲醇誘導 4 d后,取上清進行SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色,結果如圖6a所示,可見與空載體對照菌比較,重組菌誘導表達上清液在分子量約為50 kD處有明顯的條帶出現(xiàn)。表達的上清用硫酸銨沉淀,PBS透析后,進行Western blot分析。確證X-33/pPICZαA-IL2-VP2分泌表達了具有良好免疫原性的IL2-VP2蛋白,如圖6b所示。

圖6 重組酵母發(fā)酵液上清中表達產(chǎn)物SDS-PAGE和Western b lot分析

3 討論

在特異性抗原產(chǎn)生免疫反應過程中,應用細胞因子作為免疫佐劑能提高各種免疫反應的強度和速度[8]。IL-2是目前研究最多的細胞因子佐劑之一,隨抗原一起或先后給予注射,可以發(fā)揮其增強抗感染免疫或保護性免疫的作用[9]。為了增強IBDV VP2的免疫原性,發(fā)揮IL-2的佐劑效應,將IL-2和VP2抗原連接起來,采用酶切、PCR法和測序法證實了插入片段無移碼突變和堿基錯配,成功地構建了所設計的基因工程疫苗質(zhì)粒pPICZαA-IL2-VP2,檢測證實了目的基因能表達有生物活性的蛋白,為今后探索基因疫苗的設計以及IBD基因疫苗的研究奠定了基礎。IL2-VP2是一種融合蛋白,兼有IL-2的功能活性和二價親和的作用,同時可以延長 IL-2的半衰期。這種融合蛋白注射到機體后隨體液循環(huán)進入其親嗜部位,當融合蛋白中的 VP2蛋白到達機體的免疫組織或器官時,將會刺激產(chǎn)生相應的抗體,這種抗體再隨體液循環(huán)分布到機體的各個部位,從而阻止IBDV的侵入或與已侵入的病毒發(fā)生特異性結合。而IL-2蛋白可促進B細胞表達IL-2R,促使 B細胞增殖和產(chǎn)生免疫球蛋白,并刺激巨噬細胞,提高其吞噬能力,同時也能增強T細胞的殺傷活性,所以IL-2基因和VP2基因融合表達可以保證其直接作用于抗原呈遞部位,從而獲得免疫協(xié)同作用。許多研究報道包含 IL-2和病原基因的融合蛋白,能夠增強連接抗原的免疫原性,并對隨后的攻擊提供保護[10-12]。

本研究構建的IL2-VP2融合蛋白基因包含了去除IL-2終止密碼子TAA和VP2起始密碼子ATG的1 206個核苷酸,編碼融合蛋白的402個氨基酸殘基。DNA測序結果顯示,ORF讀碼框架完全正確,中間的親水性氨基酸編碼序列正確無誤,從而可以保證表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯。編碼的融合蛋白是以 IL-2的前導序列為分泌信號肽和轉(zhuǎn)錄起始位點,在lL-2的C-末端與 VP2的 N-末端之間以高親水性氨基酸相連接。免疫印跡結果表明,VP2得到很好的表達。因 VP2基因位于lL-2基因的下游,VP2基因相當于報告基因,它的表達說明IL-2蛋白也得到了成功表達。

[1] Karel A,Schat,Michael A,et al.Avian Immunosuppressive Diseases and Immune Evasion[J].Avian Immunology,2008,23 (5):299-322.

[2]Maller H,Islam M R,Raue R.Research Oninfectious Bursal Disease-the Past,the Present and the Future[J].Vet Microbiol,2003,97(1-2):153-165.

[4] Hu H L,Wang M Y,Chung C H,et al.Purification of VP3 Protein of In fectious Bursal Disease Virus Using Nickel Ionimmobilized Regenerated Cellulose-based Membranes[J].JChromatography B,2006,840(2):76-84.

[5] Ruchi P,Ramesh C,Krishna B S.Role of Interleukin-2 Regulated Proteins in Immunosupp ression by the N-alkylated Prodigiosin Analogue[J].International Immunopharmacology,2007,7(13):1695-1703.

[6] Tang M J,Wang H N,Zhou S,etal.Enhancement of the Immunogenicity of an In fectious Bronchitis Virus DNA Vaccineby a Bicistronic Plasmid Encoding Nucleocapsid Protein and Interleukin-2[J].JVirological Methods,2008,149(1):42-48.

[7] Zhou JY,Chen JG,Wang JY,et al.cDNA Cloning and Functional Analysis ofGoose Interleukin-2[J].Cytokine,2005,30 (6):328-338.

[8] Matthias K,Konstantinos S,Michael S,et al.Immunosuppression with an Interleukin-2 Fusion Protein Leads to Improved LV Function in Experimental is Chemic Cardiomyopathy[J].International Immunopharmacology,2010,10(2):207-212.

[9] Chow Y H,Huange W L,CliW K,el a1.Improvement of Hepatitis B Virus DNA Vaccines by Plasmids Coexpressing Hepatitis Surface Antigen and Interleukin-2[J].JVirol,1997,71(1):169-174.

[10] Yang Y,Chen J L,Li H,et al.Porcine Interleukin-2 Gene Encapsu lated in Chitosan Nanoparticles Enhances Immune Response of Mice to Piglet Paratyphoid Vaccine[J].Comparative Immunology,Microbiology and In fectious Diseases, 2007,30(1):19-32.

[11] Xie Z,Li H,Chen J L,et al.Shuffling of Pig Interleukin-2 Gene and Its Enhancing of Immunity in Mice to Pasteurella Ultocida Vaccine[J].Vaccine,2007,25(48):8163-8171.

[12] John H,Wyckoff III,Jeri L Howland,etal.Recombinant Bovine Interleukin 2 Enhances Immunity and Protection Induced by Brucella Abortus Vaccines in Cattle[J].Veterinary Microbiology,2005,111(1/2):77-87.