杜 麗,孟慶文,滿處日嘎,王鳳陽*

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌) ?？谑袆游锘蚬こ讨攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?70228;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150001)

1982年P(guān)almiter等將金屬硫蛋白(metalloprotein,MT)啟動子和生長激素基因拼接后導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核,獲得整合和表達(dá)該外源DNA的轉(zhuǎn)基因“碩鼠”,近年來轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域[1-2]。

為了對轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的合成與加工進(jìn)行動力學(xué)分析,尋找影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的相關(guān)因素,探究某些功能基因在模型動物一定發(fā)育階段的生理作用。從早期的金屬離子誘導(dǎo)、熱激、激素等調(diào)控系統(tǒng)到四環(huán)素誘導(dǎo),以及基于多種組織特異性的啟動子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)相繼建立,并成為轉(zhuǎn)基因動物研究的一個重要組成部分[3-7]。下面對轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 基于四環(huán)素(tetracycline,Tet)的調(diào)控系統(tǒng)(Tet on/off系統(tǒng))

該系統(tǒng)一般包括:①組織特異的啟動子、四環(huán)素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄活化因子(tet responsive transcriptional activator,tTA)或反式tTA(reverse tet responsive transcriptional activator,rtTA)組成的調(diào)控質(zhì)粒;②由四環(huán)素操縱子(tet operator,TetO)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子、目的基因組成的響應(yīng)質(zhì)粒。通過兩輪轉(zhuǎn)染,經(jīng)G418、潮霉素/嘌呤霉素篩選,建立相應(yīng)的的穩(wěn)定細(xì)胞系,在培養(yǎng)基含有四環(huán)素(或強(qiáng)力霉素,doxycyclin)或不含有四環(huán)素(或強(qiáng)力霉素)的條件下,轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受到調(diào)控[8-10]。

Tet on系統(tǒng)建立后,廣泛應(yīng)用于酵母、果蠅、小鼠、大鼠、多種細(xì)胞系及植物。但是,在某些動物的某些器官,強(qiáng)力霉素一定程度的無效誘導(dǎo),rtTA mRNA原核部分序列的不穩(wěn)定性,及其在強(qiáng)力霉素不存在的條件下,rtTA與TetO殘留的結(jié)合等因素所導(dǎo)致的靶啟動子的背景活性升高等缺陷在很大程度上限制了其應(yīng)用。針對上述不足,Urlinger S等[11]以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhenced green fluorescent protein,EGFP)為報(bào)告基因,對運(yùn)用PCR方法建立的突變r(jià)tTA DNA的文庫進(jìn)行篩選,在酵母中得到了背景更低,敏感性更高的rtTA突變體-rt-TAs-M2。強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)試驗(yàn)表明,與野生型rtTA相比,rtTAs-M2對于強(qiáng)力霉素的需要量低10倍,而且更穩(wěn)定,無強(qiáng)力霉素時,無背景表達(dá)。

TetR在真核細(xì)胞中表達(dá)時,存在于TetR編碼區(qū)中部潛在的剪切方式會導(dǎo)致非必要mRNA的產(chǎn)生,為了解決這一問題,Stebbins M J等[12]去除了TetR基因中部的潛在剪切位點(diǎn),同時在rtTA表達(dá)框兩側(cè)插入果蠅邊界元素,以消除整合位置對表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),日糧中低水平的強(qiáng)力霉素(10 μ g/mL)可以有效、迅速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在果蠅模型的胚胎、幼蟲和成蟲等階段的表達(dá)。

為了探討超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,EC-SOD,Sod3)的病理生理作用,Zou Y等[13]通過將Sod3轉(zhuǎn)基因小鼠與可誘導(dǎo)的組織特異轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,建立了四環(huán)素誘導(dǎo)的組織特異表達(dá)Sod3的轉(zhuǎn)基因小鼠,進(jìn)一步的分析表明,肝特異性表達(dá)Sod3的轉(zhuǎn)基因小鼠EC-SOD水平增加,神經(jīng)元特異表達(dá)Sod3的轉(zhuǎn)基因小鼠ECSOD水平在海馬和大腦皮層增加,小鼠食物中添加的強(qiáng)力霉素能夠開啟或關(guān)閉轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

2 基于酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的時空調(diào)控系統(tǒng)

基于Gal4及其結(jié)合位點(diǎn)的上游激活序列(upstream activation sequence,UAS)建立的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時空調(diào)控系統(tǒng)一般包括:①由Gal 4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人的雌激素受體的C端融合在一起的調(diào)控質(zhì)粒;②數(shù)個UAS、TATA盒、目的基因組成的Gal 4響應(yīng)質(zhì)粒。整合有調(diào)控質(zhì)粒和響應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞或模型動物,在雌激素存在的情況下,Gal4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域得到表達(dá),并結(jié)合到響應(yīng)質(zhì)粒的UAS序列啟動靶基因的表達(dá)。由于絕大多數(shù)哺乳動物既不表達(dá)內(nèi)源性的雌激素受體,也不表達(dá)任何Gal4樣活性的蛋白,因此,該系統(tǒng)具有較強(qiáng)的選擇性。

Braselmann S等[14]將單純皰疹病毒蛋白VP16的強(qiáng)激活結(jié)構(gòu)域加入到調(diào)控質(zhì)粒中,增強(qiáng)了Gal 4-ER的轉(zhuǎn)錄激活能力,并且消除了由于細(xì)胞系不同而導(dǎo)致的背景差異,同時構(gòu)建了由4個Gal 4結(jié)合位點(diǎn)、小鼠Ⅱ型主要組織相容復(fù)合物的CCAAT盒、來自腺病毒晚期轉(zhuǎn)錄單位(—39～+15)的起始區(qū)和TATA盒組成的低背景、高響應(yīng)的Gal4響應(yīng)啟動子序列調(diào)控下的c-fos表達(dá)載體。將該表達(dá)載體短暫轉(zhuǎn)染NIH3T3和P19細(xì)胞系,培養(yǎng)基中加入雌激素,Gal 4-ER-VP16導(dǎo)致的響應(yīng)啟動子的活性提高了100倍。在整合有調(diào)控質(zhì)粒與響應(yīng)質(zhì)粒的大鼠成纖維細(xì)胞中加入雌激素1 h～2 h后,fos表達(dá)水平開始升高,并導(dǎo)致了該細(xì)胞系依賴雌激素的轉(zhuǎn)化。

為了在果蠅胚胎后發(fā)育階段在幼蟲神經(jīng)肌肉接頭表達(dá)轉(zhuǎn)基因,Osterwalder T等[15]成功的建立了基于Gal4的條件性組織特異轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)。首先,選擇了神經(jīng)特異表達(dá)的胚胎致死異常視力樣基因(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)的啟動子和肌肉特異表達(dá)的肌球蛋白重鏈基因(myosin heavy chain,MHC)的啟動子,建立組織特異性(突觸前或突觸后)表達(dá)基因開關(guān)(RU486依賴的孕激素受體-Gal4融合蛋白,GeneSwitch)的果蠅,并和表達(dá)UAS轉(zhuǎn)基因的果蠅交配,RU486可以開啟或關(guān)閉目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。將一定劑量的GeneS-witch激活劑-RU486混在食物中飼喂,或者經(jīng)“幼蟲浴”(將第3齡期幼蟲置于一定濃度RU486環(huán)境下一定時間),GeneSwitch活化,UAS轉(zhuǎn)基因在突觸前后在一定的時間條件下得到表達(dá)。在表達(dá)狀態(tài)下,如果將果蠅移入無RU486的條件下,GeneS-witch介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)將關(guān)閉。在幼蟲發(fā)育的大部分時期,在激活劑不存在的情況下,UAS轉(zhuǎn)基因背景轉(zhuǎn)錄水平非常低。

Asakawa K等[16]利用T ol2轉(zhuǎn)座子,設(shè)計(jì)了GAL4基因陷阱方法,在轉(zhuǎn)基因斑馬魚的特定細(xì)胞表達(dá)Gal4。將Gal4轉(zhuǎn)基因魚和UAS-報(bào)告基因和效應(yīng)基因轉(zhuǎn)基因魚雜交,使詳細(xì)分析斑馬魚基因在特定的細(xì)胞表達(dá)成為可行。

3 基于小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)的時空調(diào)控系統(tǒng)

在ES細(xì)胞未分化狀態(tài)下,干擾素(interferon)依賴的誘導(dǎo)系統(tǒng)能夠開啟/關(guān)閉氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)的表達(dá),但I(xiàn)FN-β持續(xù)刺激ES細(xì)胞,非?？赡苡绊懫湔０l(fā)育[17]。Zhang Y等[18]應(yīng)用三苯氧胺(tamaoxifen)調(diào)控下的Cre重組酶(Cre recombinase)導(dǎo)致的Cre的重組,激活穩(wěn)定整合在ES細(xì)胞的β-半乳糖苷酶(LacZ),但三苯氧胺的用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了細(xì)胞生長與小鼠妊娠的中毒劑量,并且存在有持續(xù)的LacZ的背景表達(dá)。

Vallier L等[19]將Cre重組酶與突變的雌激素受體融合,構(gòu)建了對4′-羥基三苯氧胺(4′OH-tamoxifen,4′OHT)高度敏感的調(diào)控質(zhì)粒,同時還構(gòu)建了受Cre重組酶調(diào)控,由內(nèi)源性啟動子調(diào)控下的人堿性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。經(jīng)過藥物篩選(G418、潮霉素),整合有調(diào)控質(zhì)粒和響應(yīng)質(zhì)粒的ES細(xì)胞在分化及未分化狀態(tài)下,在體內(nèi)或體外,在非毒性4′-OH T的嚴(yán)格控制下均能表達(dá)轉(zhuǎn)基因hAP。

4 基于RNAi的時空調(diào)控系統(tǒng)

近年來,做為在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因表達(dá)的一種重要手段,應(yīng)用RNAi技術(shù)建立可調(diào)控的轉(zhuǎn)基因動物模型方面的探索已經(jīng)取得了很好的進(jìn)展[20]。Higuchi M等[21]利用RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子H1在AGS細(xì)胞系表達(dá)酪氨酸磷酸酶2(Src homology phosphatase-2,SHP-2),建立了異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(the lactose analogisopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)表達(dá)系統(tǒng),SHP-2的表達(dá)受到調(diào)控。Wu R H等[22]建立的可誘導(dǎo)的siRNA表達(dá)系統(tǒng)能夠有效、有條件的調(diào)控基因的表達(dá),在非誘導(dǎo)條件下,背景效應(yīng)很低,在短暫轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系,熒光素酶和P53的表達(dá)被條件性調(diào)控。

Kotnik K等[23]構(gòu)建了靶向胰島素受體(insulin receptor,IR),四環(huán)素誘導(dǎo)短發(fā)夾RNA(short hairpin,shRNA)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因基因抑制(knockdown)大鼠,強(qiáng)力霉素可以廣泛性抑制IR的表達(dá)及其信號通路,導(dǎo)致可逆的劑量依賴性的血糖增加,成功建立了可誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型?；谕瑯拥募夹g(shù)原理,Herold M J等[24-25]也分別成功構(gòu)建了可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠模型。

5 結(jié)語

在多種模式動物成功建立轉(zhuǎn)基因表達(dá)時空調(diào)控系統(tǒng)的同時,對誘導(dǎo)藥物的使用劑量、轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平的掌握等方面還需要進(jìn)一步的深入研究。隨著諸多基因功能背景的逐步澄清及一些相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,在選擇最佳的模式動物,運(yùn)用精細(xì)的技術(shù)手段,精確、嚴(yán)格的時空調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的研究領(lǐng)域,必將有更大的突破,并廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究。

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