林榮高,黎滿香,蔣 偉,陳 滔

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

豬鏈球菌(Streptococcus suis)是革蘭陽性球菌,圓形或卵圓形,呈雙或鏈狀排列,是豬的最重要致病菌之一[1]。臨床上可以引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎及突然死亡等,對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重影響[2-3]。1968年在丹麥首次報道豬鏈球感染人,截至2008年底世界所報道的病例超過400例[4],實際上受豬鏈球菌感染的人數(shù)遠比報道的多[5]。1998年、2005年我國先后兩次發(fā)生豬鏈球菌感染人后,人們意識到豬鏈球菌是一種威脅公共衛(wèi)生的人獸共患病原。豬鏈球菌種類繁多,分型困難,蘭氏法(lancefield)是應(yīng)用較早的技術(shù),可將豬鏈球菌分為R、S、T群,然而有相當(dāng)部分菌株不能分群,許多地區(qū)特別是發(fā)展中國家分群血清難以獲得且價格昂貴[6]。雖然按溶血性可將全部菌株分為α、β、γ三種類型,但過于籠統(tǒng)。利用耐藥性和生化特性分型的方法也有一定價值,但難于統(tǒng)一和標準化,因為不同地區(qū)的分離株的生化特性和耐藥性差異大[7]。根據(jù)莢膜多糖抗原差異,目前可將豬鏈球菌分為35個血清型,1～34型及1/2型,然而還是有相當(dāng)部分菌株無法定型[8]。其中,豬鏈球菌2型被認為是流行最廣,致病性最強的型,但2型豬鏈球菌(SS2)中也存在強毒株、弱毒株和無毒株[9],這說明同一血清型還存在亞型。在過去的研究中傳統(tǒng)的分型方法起到重要的作用,然而還是存在不足,如區(qū)分度低、難于統(tǒng)一,往往只基于一類表型,描述菌株生物學(xué)特性差異的能力差。近年,分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展給豬鏈球菌分型帶來了新的技術(shù)手段。

1 多位點序列分型

多位點序列分型技術(shù)(multilocus sequence typing,M LST)是一種基于PCR擴增、基因測序的基因分型方法。King S J等[10]對英國294株豬鏈球菌的4個管家基因進行擴增并測序,獲得92個序列型(ST),ST1出現(xiàn)頻率最多,該序列曾被6個國家共報道141次。此外,ST1多來自腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥的樣本,ST27,ST87則主要來自肺臟,與臨床背景相關(guān)良好。Princivalli M S等[11]對意大利2003年—2007年分離的菌株研究時也發(fā)現(xiàn)ST1主導(dǎo)著這幾年的流行,并且大都攜帶MRP,EF,和suilysin基因。與歐洲報道相比,我國分離株則以ST7為主,其次是ST1。葉長蕓等對國內(nèi)兩次暴發(fā)(1998年江蘇、2005年四川)的豬鏈球菌進行研究,發(fā)現(xiàn)114株豬鏈球菌中有106株屬于ST7,王洪敏等[12-13]的研究也有類似的結(jié)論,5株廣東省人源SS2中有3株屬于ST7,2株屬于ST1。研究表明,ST7刺激T細胞增殖和誘導(dǎo)致炎因子釋放的能力比歐洲流行株ST1更強[14]。Dang H等[15]從越南一名死者血液中分離到16型豬鏈球菌,經(jīng)MLST分析證實其屬于一個新的序列型,不同屬以往報道的任一克隆系,該序列型很可能與16型豬鏈球菌有關(guān)。不難看出,MLST最大特點是不同的實驗室獲得的結(jié)果可以比較,易于統(tǒng)一,標準化,并可經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)共享,現(xiàn)已有許多學(xué)者將該技術(shù)用于流行病學(xué)研究中。

2 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)是通過酶切細菌基因組,然后對酶切片段進行瓊脂糖凝膠電泳,不斷改變電場方向,從而在凝膠上獲得多態(tài)性DNA圖譜。Vela A I等[16]運用該方法可將西班牙74個畜群的302株豬鏈球菌分為60個基因型,其中45%的基因型由單一分離株構(gòu)成。值得強調(diào)的是,該試驗在同一血清型可以分出多個脈沖電泳型(pulsotypes),如9、2型、7型可分別獲得24、10、6個脈沖電泳型。這就說明許多血清型中可能還存在亞型,而傳統(tǒng)的分型方法很難描述同一血清型中菌株間的差異。Marois C等[17]在對來自扁桃體的豬鏈球菌研究時發(fā)現(xiàn),利用莢膜多糖抗原法進行血清型鑒定時有58%菌株無法定型,說明莢膜抗原分型法不足以區(qū)分所有的豬鏈球菌,而應(yīng)用PFGE技術(shù)進行基因分型在其研究中起到重要的作用。Berthelot-Herault F等[18]對法國的123個株豬鏈球菌進行PFGE研究,98%菌株獲得定型并可歸結(jié)為74種脈沖電泳型,按60%同源性歸類可獲取A、B、C 3個組,而來自臨床病豬和人源分離株集中在B組,體現(xiàn)PFGE技術(shù)的相當(dāng)高的區(qū)分度,并且分型效果能與臨床相關(guān)。PFGE具有很高的分辨率,重復(fù)性好,但需要特殊的儀器和專業(yè)人員操作,可比性不及MLST,較難于統(tǒng)一標準化。不過我國正在建立各病原菌PFGE分析標準化操作規(guī)程,建立標準圖譜數(shù)據(jù)庫,即不同病原菌各自的酶切分析和電泳參數(shù)標準,其應(yīng)用會越來越廣泛[19]。

3 限制性片段長度多態(tài)性分析

Mogollond J D等[20]曾應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)對豬鏈球菌進行研究,其操作簡單歸結(jié)為染色體DNA的提取,HaeⅢ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化,瓊脂糖凝膠電泳,直接分析DNA多態(tài)性圖譜。研究發(fā)現(xiàn)用HaeⅢ消化時有23種血清型產(chǎn)生易于分辨的圖譜,9、11、12、16型的DNA則對HaeⅢ消化產(chǎn)生抵抗。用HindⅢ獲取的圖譜中9型和16型有很大的差異。通過對110個菌株進行研究,獲得多種DNA指紋圖譜并與臨床有相關(guān)性,表明DNA多態(tài)性技術(shù)可以用做流行病學(xué)調(diào)查的工作。Amass S F等[21]的用RFLP技術(shù)證明了仔豬的感染由垂直傳播所致,從同群的3頭母豬及所產(chǎn)的仔豬身上分離到5型豬鏈球菌,對菌株進行RFLP分析發(fā)現(xiàn):從仔豬及其對應(yīng)的母豬中分離到的菌株有相同的DNA指紋圖譜,而與沒有母源關(guān)系的樣本的DNA圖譜有較大差異。本試驗利用DNA指紋圖譜可以分辨親緣很近的菌株間的差異,而傳統(tǒng)方法則較難做到這一點。不過,RFLP技術(shù)操作也比較繁瑣,多態(tài)性圖譜不及AFLP和PFGE清晰,其很可能被其他分子技術(shù)代替。

4 擴增片段長度多態(tài)性

擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技術(shù)是由RFLP演變而來,其通過隨機擴增限制性片段獲取多態(tài)性。Rehm T等[22]對116株豬鏈球菌進行AFLP分析發(fā)現(xiàn)所有菌株可以分為A、B、C、D 4個群和A1、A2、C1、C2亞群。其中亞群A1主要由臨床發(fā)病cps1菌株和mrp+epf+(或epf*)sly+cps2+菌株構(gòu)成;mrp*cps9+菌株則歸為A2;C1、C2主要由cps2、cps7肺炎菌株和epf—sly—菌株構(gòu)成。AFLP分型與臨床背景、毒力基因間有清晰聯(lián)系,可以作為流行病學(xué)研究的一種手段。Baums C G等[23]對83株S.suis進行AFLP分析表明來自病豬并且攜帶mrp、epf、sly、cps2基因的菌株和cps2+野牛分離株可以歸結(jié)為一類,而sly—epf—的SS2則歸為另一類,兩類的之間AFLP圖譜同源性為45%,其AFLP分型效果與毒力基因有相關(guān)性。AFLP技術(shù)獲得的多態(tài)性豐富,多態(tài)性圖譜清晰并易于分析解釋,但是操作也相對復(fù)雜,涉及DNA提取、酶切、PCR擴增和核酸標記技術(shù)。

5 隨機擴增的多態(tài)性DNA

隨機擴增的多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)是運用隨機引物對菌株基因組DNA進行擴增,獲取多態(tài)性DNA圖譜。Chatellier S等[24]用隨機引物對88株SS2的基因進行隨機擴增,獲得23種DNA多態(tài)性圖譜,來源于人和豬的分離株具有共同的圖譜,由此認為感染豬與人類的菌株可能是共同來源。結(jié)合各菌株的SLY、MRP、EF毒力基因檢測,發(fā)現(xiàn)所有SLY+MRP+EP+菌株的PAPD圖譜可以歸結(jié)為一類,而SLY—MRP—EP—則可歸為另一類,這與毒力基因之間有很好的相關(guān)性,因此利用該技術(shù)應(yīng)用于豬鏈球菌乃至其他病原菌的毒力分析具一定的意義。試驗還發(fā)現(xiàn)北美和歐洲的菌株具有相似的RAPD圖譜,由此推定其有親緣關(guān)系。與其他分子生物分型技術(shù)相比,RAPD技術(shù)操作簡易,成本低,并且可以針對細菌全部基因組做隨機檢測,但其重復(fù)性較差,標準化困難。

6 核糖體分型

Staats J J等[25]運用核糖體分型(ribotyping)技術(shù)對豬鏈球菌毒力進行研究,經(jīng)DNA提取、酶切、電泳分離、Southern blot后,用地高辛標記的16 S、23 S rRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA作探針雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn),強毒株具有與弱毒株、無毒株不同的雜交圖譜。利用這種方法可以鑒定SS2的毒力。Smits H E等[26]用同位素標記一個1 066 bp的16sRNA基因片段作探針與42株豬鏈球菌的DNA片段雜交,結(jié)果顯示致病SS2菌株和高致病SS1有不同的雜交圖譜,無毒株之間的雜交圖譜具有很高的同源性。也有報道[27]說用核糖體分型的方法發(fā)現(xiàn)腦膜炎菌株有獨特的DNA圖譜,并且對磺胺甲異惡唑具有耐藥性,而來自肺炎、敗血癥、心包炎、心內(nèi)膜炎菌株則屬于另一類圖譜且對四環(huán)素具有耐藥性。這種方法涉及Southern印跡和核酸標記,比較耗時,成本高,難以在普通實驗室廣泛應(yīng)用。

7 PCR-限制性片段長度多態(tài)性

PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)是通過PCR擴增某個特定的DNA片段,然后對該片段進行RFLP分析。Marois C等[28]運用該法對138株豬鏈球菌進行研究,其選擇的PCR擴增片段為部分16 S rRNA基因和部分23 S rRNA基因,以及16 S～23 S rRNA基因之間序列(intergenic spacer region,ISR),稱之ISR-RFLP。結(jié)果表明,這種方法可以分辨95%以上的菌株,人源分離株間的基因差異小于豬源分離株,并且有兩種基因圖譜中為SS2菌株特有。23 S rRNA分子比較大(約3 kb),尚未在細菌的分類和鑒定中得到廣泛應(yīng)用,ISR比16 S rRNA相對變異大,因此應(yīng)用16 S～23 S rRNA基因及ISR對親緣近的菌株的分類和鑒定可以彌補了16 S rRNA序列的缺陷。就特定DNA片段分析而言,PCR-RFLP不及測序準確,但對大片段DNA測序的成本也是相當(dāng)高。

8 基因測序

基因測序(sequencing)是根據(jù)16 S DNA差異對細菌分類是公認的一種理想方法。Rasmussen S R等[29]對幾種血清型豬鏈球菌進行16 S DNA擴增并測序后進行遺傳進化樹分析,發(fā)現(xiàn)血清型9、20、26可以歸結(jié)為一簇,血清型25、27、2、24、1、22可歸結(jié)為另一相對獨立的一簇。這項研究闡述了幾種血清型間親緣關(guān)系。Chatellier C等[30]對35種血清型的菌株的16 S RNA基因測序,分析后發(fā)現(xiàn)各參考株的核苷酸同源性在93.49%～100%之間,許多種血清型16 S RNA基因同源性很高。16 S RNA基因系統(tǒng)進化樹中血清型32,33,34與其他菌株分屬兩相對獨立分支。遺憾的是,16 S RNA基因的相對保守性,不能清晰地描述豬鏈球菌菌株之間的差異。相比之下,其他一些基因可能勝任,60 ku chaperonins基因(Cpn60)普遍存在并且高度保守已經(jīng)被用于分類學(xué)和分子進化研究。Brousseau R等[31]對35種血清型的豬鏈球菌的部分Cpn60基因經(jīng)行擴增、測序,經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)參考株的Cpn60基因系統(tǒng)進化關(guān)系和16 S RNA序列獲得的進化關(guān)系相當(dāng)吻合。此外,Cpn60基因較16 S RNA基因又有更多的變異,在區(qū)分菌株間的差異可能更有利。Kutz R等[32]對19株SS2的谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase enzymes,GDH)全部及側(cè)翼序列經(jīng)擴增測序,發(fā)現(xiàn)菌株GDH基因是一個具有1 820 bp的片段,其中包含1 344個核苷酸的閱讀框架,雖然菌株間核苷酸序列存在較多差異,但大多是沉默的。其中214、886、895、913、988基因位點的變異對應(yīng)氨基酸變異為Tyr72-to-Asp、Thr296-to-Ala、Ala299-to-Ser、Glu305-to-Lys和Glu330-to-Lys。強毒株與中等毒力株、無毒力株相比,其發(fā)生了Ala299-Ser、Glu305-Lys和Glu330-Lys氨基酸置換,這就暗示基于GDH的分型法可以作為預(yù)測菌株致病情況的標志。

9 結(jié)語

與傳統(tǒng)的分型方法相比,基于分子生物技術(shù)的分型方法體現(xiàn)了高靈敏性,簡易性,能從基因水平反映菌株的生物學(xué)特性的差異。其中核糖體分型由于其操作復(fù)雜,較耗時,成本高,運用該技術(shù)對豬鏈球菌分型的報道不多,PAPD、AFLP、RFLP技術(shù)可以針對全基因組進行分析,PAPD操作最為簡易,成本最低,AFLP則有多態(tài)性豐富,圖譜清晰的特點,目前運用還比較多。PCR-RFLP和基因測序方法則針對部分基因片段,選擇合適的基因片段至關(guān)重要,比起PCR-RFLP,測序方法可以精確掃描每個堿基、分辨力極高,不過成本也較高。MLST技術(shù)的可比性和PFGE的高分辨率最為突出,并能檢測細菌基因組的多個位點,這使這兩項技術(shù)越來越受青睞?？傊?分子生物技術(shù)給細菌分型引入了新的思路,正如Zuckerkandl E和Pauling L曾談到“分子是進化的歷史文件”[33],以分子生物學(xué)技術(shù)將會成細菌分型的強有力手段,并將會是流行病學(xué)研究的重要工具。

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