駱建才,劉義志,尚輝琴,冀 君,謝青梅*

(1.深圳市農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司,廣東深圳518023;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510642)

豬流感(Swine influenza,SI)是由甲型(A型)流感病毒引起的豬的一種急性傳染病。豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是流感病毒的膜外蛋白,可與靶細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合,幫助病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面,使病毒得以侵入細(xì)胞。血凝素蛋白與病毒易感的宿主范圍和宿主對(duì)病毒感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有直接聯(lián)系,其裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素[1]。流感病毒以其基因快速突變、表面抗原頻繁變異而不斷引起新的流行。HA的受體結(jié)合位點(diǎn)(receptor binding site,RBS)對(duì)宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力的特異性對(duì)于流感病毒感染的宿主范圍起重要作用[2]。HA基因是病毒基因組中變異最快的,對(duì)于HA基因的研究在分子流行病學(xué)調(diào)查、毒株與亞型、疫情監(jiān)測(cè)等方面具有重要的意義。近來年很多學(xué)者對(duì)不同地區(qū)不同時(shí)間的SIV的HA基因進(jìn)行了研究分析。劉大飛等[2]對(duì)分離自廣東的一株H1N1亞型SIV研究表明,其HA基因可能來源于類人譜系的流感病毒;范鋒等[3]從無錫某豬場(chǎng)分離得到的H1N1亞型SIV研究表明,分離株屬于古典型H1N1 SIV;李敏等[4]從廣東不同豬場(chǎng)分離得到4株H3N2亞型SIV,證明HA基因?qū)儆诮惾薍3N2亞型流感病毒;溫納相等從廣東某豬場(chǎng)分離到9株豬流感病毒,4株為H1N1亞型,5株為H3N2亞型;趙樸等[5]成功構(gòu)建了pMe-BacA-HA轉(zhuǎn)移載體,為開發(fā)HA亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

我國(guó)華南地區(qū)具備孕育流感病毒的自然條件和環(huán)境,在病毒起源和分子流行病學(xué)研究上,是世界新流感病毒亞型出現(xiàn)和流感暴發(fā)的疫源地[6-8],因此廣東地區(qū)流感毒株在未來流感病毒變異和流行中的作用值得深入研究。本研究對(duì)廣東地區(qū)2009年5—11月及2008年部分H1N1豬流感病毒的HA基因進(jìn)行克隆和進(jìn)化分析以及編碼的蛋白氨基酸重要的功能位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì),在一定程度上反映廣東省H1N1亞型豬流感病毒的分子變異特征,為廣東及全國(guó)的豬流感疫情監(jiān)測(cè)和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 毒株分離于廣東一些豬場(chǎng),分別命名為A/swine/Guangdong/02/2008/H1N1、A/swine/Guangdong/07/2008/H1N1、A/swine/Guangdong/09/2008/H1N1、A/swine/Guangdong/07/2009/H1N1、A/swine/Guangdong/05/2009/H1N1、A/swine/Guangdong/06/2009/H1N1、A/swine/Guangdong/09/2009/H1N1、A-swine/Guangdong/11/2009/H1N1。

1.1.2 載體和主要試劑 RNA提取試劑Trizol LS Reagent為GIBCO公司產(chǎn)品,AMV反轉(zhuǎn)錄酶及相關(guān)試劑、Taq聚合酶為Promega公司產(chǎn)品;pGEM-Teasy載體和Agarose Gel DNA Purification Kit為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)合成 參照文獻(xiàn)用流感病毒通用引物擴(kuò)增HA基因,即HA-F:AGCAAAAGCAGGGGAAAA;HA-R:TCTCATGTCTCTGAAATCCT,包括全長(zhǎng)的HA基因。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 病毒RNA的提取 參照Trizol LS Reagent說明書進(jìn)行,提取RNA后直接用于RT-PCR。

1.2.3 HA基因的RT-PCR擴(kuò)增 按常規(guī)RTPCR方法擴(kuò)增HA基因,反應(yīng)條件為:50℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94℃預(yù)變性3 min;94℃40 s,55℃40 s,72℃2 min,循環(huán)30次;最后72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ L產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠系統(tǒng)上觀察目的片段。

1.2.4 HA基因的克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物純化回收,連接于T載體上。連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用PCR篩選陽性重組質(zhì)粒,同時(shí)送陽性菌液到北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序鑒定。

1.2.5 HA基因序列比較和功能進(jìn)化分析 應(yīng)用Blast和DNA Star分析軟件對(duì)測(cè)序基因片段進(jìn)行整個(gè)閱讀框架的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 HA基因的RT-PCR擴(kuò)增

經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,擴(kuò)增到的HA基因片段約1 757 bp,包括HA基因完整閱讀框(ORF)1 701 bp(圖1),與預(yù)期一致。

圖1 HA基因RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic analysis of HA gene RT-PCR products

2.2 HA同源性及遺傳演化分析

HA氨基酸序列同源性分析表明,與經(jīng)典SIV株同源性在92.3%～97.9%之間,與2009年人H1N1流感病毒同源性在80.4%～92.4%之間;與歐洲類禽SIV分離株同源性在80.4%～84.1%之間。從進(jìn)化樹可以看到,本次分離得到的8株H1N1豬流感病毒的HA基因與A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1聚在一塊形成一支,并以高Bootstrap值支持(100%),與類禽豬流感病毒的HA進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn);經(jīng)典的5株豬流感HA有4株聚在一塊形成一支,其中A-swine-Maryland-23239-1991-H1N1與本次分離得到的12株HA及A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1進(jìn)化關(guān)系較近,聚在另外一大支上,以高Bootstrap值支持(96%);類禽豬流感病毒的3株單獨(dú)聚在一起形成一支Bootstrap值為100%;與2009年甲型H1N1流感病毒和經(jīng)典豬流感病毒分離株親緣關(guān)系較近(圖2)。

圖2 H1N1豬流感病毒HA基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree from the HA gene of H1N1 subtype swine influenza virus

2.3 HA基因編碼蛋白氨基酸序列變異分析

對(duì)本次分離得到的8株HA基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行分析,均含有8個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),且糖基化位點(diǎn)相同。對(duì)其切割位點(diǎn)處的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其序列為IPSIQSR↓G。

通過比較8株HA基因的抗原表位,發(fā)現(xiàn)其抗原表位無大的變異;與2009年甲型H1N1流感病毒及類禽豬流感病毒的HA蛋白抗原表位進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)有5處變異(圖3)。分離株HA與類禽豬流感病毒HA比較發(fā)現(xiàn),在50位～60位,150位～160位,180位～190位,250位～260位,290位～300位氨基酸發(fā)生變化,導(dǎo)致其抗原表位發(fā)生了明顯變異;與2009年甲型H1N1流感病毒HA比較發(fā)現(xiàn),在50位～60位,80位～70位,130位～140位,180位～190位,250位～260位氨基酸發(fā)生變化,導(dǎo)致其抗原表位發(fā)生了明顯變異。

圖3 HA蛋白潛在的抗原決定簇及其特定區(qū)域位于蛋白表面的可能性比較Fig.3 Comparison of the antigenic determinant and surface probability plot of HA protein

3 討論

同源性比較及進(jìn)化關(guān)系表明:本研究的分離毒株同源性很高(平均約99.8%以上),進(jìn)化關(guān)系很近,都聚在一支上。表明2008年—2009年之間廣東省內(nèi)流行的H1N1 SIV未發(fā)生明顯的變異;與經(jīng)典SIV進(jìn)化關(guān)系很近且同源性較高(最高為97.9%),與類禽SIV進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),本研究毒株仍為經(jīng)典SIV;與/swine/Shanghai/3/2005/H1N1進(jìn)化關(guān)系很近,位于同一支上且同源性高(平均約為99.6%),可以推測(cè)本研究毒株與2005年上海毒株可能起源于同一毒株,2008年—2009年廣東省內(nèi)流行的H1N1 SIV可能源于2005年上海毒株。

HA蛋白是SIV最主要的表面蛋白,也是宿主免疫系統(tǒng)最主要的靶抗原,因此對(duì)HA基因氨基酸的研究極其重要。本研究對(duì)8株分離株的HA蛋白的裂解位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分析。豬流感病毒的HA基因存在著裂解位點(diǎn)(PCS)、糖基化位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)等重要的氨基酸位點(diǎn)[9],HA糖蛋白的抗原特性直接影響病毒的感染性、致病性、宿主特異性、病毒在機(jī)體內(nèi)的增殖傳播及病毒的組織嗜性。Matrosovich M等[10]研究發(fā)現(xiàn),HA1和HA2裂解位點(diǎn)處糖基化位點(diǎn)的增加會(huì)降低流感病毒與細(xì)胞受體的親和力和病毒釋放能力,裂解位點(diǎn)處多1個(gè)堿性氨基酸的插入和糖基化位點(diǎn)的缺失均能使HA對(duì)蛋白酶切割的敏感性增強(qiáng),而使致病力提高。本研究毒株HA基因的抗原表位無大的變異。8株分離毒株均含有8個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),且糖基化位點(diǎn)相同。對(duì)其切割位點(diǎn)處的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其序列為IPSIQSR↓G。沒有發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)和裂解位點(diǎn)的變化,說明本次獲得的分離株對(duì)宿主的致病力沒有發(fā)生大的變化,還是屬于低致病性毒株。

有研究報(bào)道,HA序列的第226位氨基酸決定病毒的宿主特異性,當(dāng)SIV第226位的氨基酸為蛋氨酸(M)時(shí),病毒就具有感染禽的的潛力。本次8個(gè)分離毒株的第226位的氨基酸為纈氨酸(V),未發(fā)生變異,因而不具有感染禽類的危險(xiǎn)。

本研究通過對(duì)8株H1N1亞型SIV HA基因克隆的基礎(chǔ)上對(duì)其遺傳演化關(guān)系進(jìn)行了分析,并對(duì)HA基因編碼的蛋白氨基酸重要的功能位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì),在一定程度上揭示了廣東省流行的H1N1亞型豬流感病毒仍然屬于經(jīng)典SIV,并未發(fā)生大的變異。

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