劉 兵 歐 微 彭超華

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)(長江大學附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院藥學部，湖北 荊州 434000) (武漢工業(yè)學院醫(yī)學院，湖北 武漢 430023)

IL-1β體外誘導皮質(zhì)與中腦腹側(cè)神經(jīng)干細胞向TH陽性細胞分化差異研究

劉 兵 歐 微 彭超華

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023)(長江大學附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院藥學部，湖北 荊州 434000) (武漢工業(yè)學院醫(yī)學院，湖北 武漢 430023)

目的：探討IL-1β對鼠胚腦皮質(zhì)區(qū)與中腦區(qū)來源的神經(jīng)干細胞向酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性細胞分化的差異。方法：體外分別分離、培養(yǎng)胚鼠腦皮質(zhì)區(qū)與中腦區(qū)來源的神經(jīng)干細胞并傳代，在有血清條件下IL-1β誘導分化，并設(shè)空白組對照，分化結(jié)果行免疫熒光細胞化學技術(shù)鑒定，鏡下計數(shù)陽性細胞比例。結(jié)果：經(jīng)誘導，中腦神經(jīng)干細胞在IL-1β作用下分化出TH陽性細胞，其中比例約14%；皮質(zhì)神經(jīng)干細胞未分化出TH陽性細胞。結(jié)論：中腦神經(jīng)干細胞在IL-1β作用下可以明顯分化出TH陽性細胞，而皮質(zhì)神經(jīng)干細胞不能分化，二者體外在向TH陽性細胞分化性能上存在差異。

神經(jīng)干細胞； 皮質(zhì)； 中腦； 分化；差異

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種嚴重威脅中老年人的神經(jīng)退行性疾病，目前臨床上尚無有效的治愈手段，神經(jīng)干細胞替代移植是PD治療新的策略與希望[1]。如何在體外獲得足量的多巴胺能神經(jīng)元以替代壞死的神經(jīng)元是治療PD的關(guān)鍵所在。本實驗用細胞培養(yǎng)技術(shù)體外分別分離、培養(yǎng)胚鼠腦皮質(zhì)區(qū)與中腦區(qū)來源的神經(jīng)干細胞并傳代，在有血清條件下IL-1β對它們進行誘導分化, 免疫熒光細胞化學技術(shù)觀察檢測比較其對皮質(zhì)和中腦源神經(jīng)干細胞向TH陽性神經(jīng)元定向誘導分化的可能性及其效能,以期為神經(jīng)干細胞的基礎(chǔ)研究和帕金森病的細胞移植替代治療研究提供一定的實驗資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 孕11～15d昆明小鼠(E11-E15d SPF級)由武漢大學實驗動物中心提供。

1.1.2試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，特優(yōu)級胎牛血清(FBS)、B27均購自GIBCO公司(USA)；堿性成纖維生長因子(bFGF)、IL-1β購自Peprotech公司(USA)； 胰酶(Trypsin)、DNA酶1(DNase1)、左旋多聚賴氨酸(PLL)和DAPI購自SIGMA公司(USA)。抗體：羊抗鼠anti-nestin單克隆一抗及相應(yīng)的熒光標記二抗；小鼠抗大鼠anti-TH單克隆一抗以及相應(yīng)的熒光標記二抗均購自美國Alpha Diagnostic Intl.Inc公司；其余試劑均為市購。

1.2方法①兩種NSCs的分離、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、見文獻[2-3] 。②兩種NSCs向TH陽性神經(jīng)元的誘導分化。取傳2～3代的神經(jīng)干細胞克隆,置入裝有1%多聚賴氨酸處理過蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,對中腦NSCs(A組)和皮質(zhì)NSCs(B組)實驗組均加入200μg/L IL-1β[4]，在含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中進行誘導分化, 與A、B組相對的空白組(分別為C組和D組)在含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中分化，每2～3d換液，觀察比較并記錄。培養(yǎng)7～10d后收獲細胞。③免疫細胞化學鑒定、細胞計數(shù)與統(tǒng)計學處理的方法同文獻[5]。

2 結(jié) 果

2.1中腦神經(jīng)干細胞向TH陽性神經(jīng)元的分化及其陽性率取傳2～3代的神經(jīng)干細胞克隆,置入裝有1%多聚賴氨酸處理過蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，12h可見中腦神經(jīng)球之間伸出細長突起聯(lián)系，2d左右見細胞沿長突起從球中爬出，并發(fā)短小棘突，隨后細胞棘突延長增多。細胞與細胞以及球體與球體之間形成廣泛纖維網(wǎng)絡(luò)(見彩色圖版Ⅰ之圖1)。比較各組分化情況見A組相對C組神經(jīng)球細胞爬出要早，伸出的突起也更豐富。細胞分化10d后TH免疫熒光檢測，各組均可見TH陽性細胞，這些陽性細胞胞體形態(tài)以圓形、橢圓形多見，TH主要表達于胞核周圍和突起部，突起呈串珠樣，有單極、雙極和多極；A組(見彩色圖版Ⅰ之圖2)與C組(見彩色圖版Ⅰ之圖3)相比，A組TH陽性細胞在形態(tài)上明顯更成熟。細胞計數(shù)結(jié)果如下：誘導A組和C組的TH陽性率分別為(14.3±0.7)%、(2.3±1.2)%，A組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。

2.2皮質(zhì)神經(jīng)干細胞向TH陽性神經(jīng)元的分化皮質(zhì)神經(jīng)球的分化鏡下觀與中腦神經(jīng)干細胞球類似，只是分化速度相對較慢，球體完全分化所需的時間要長。比較皮質(zhì)各組分化情況發(fā)現(xiàn)B組神經(jīng)球細胞比D組爬出要早，球體分化得要快，分化細胞伸出的突起也更多更長。對B組和D組分化16d細胞分別染色，TH均呈現(xiàn)陰性，均無TH陽性神經(jīng)元誘導出(見彩色圖版Ⅰ之圖4)。

3 討 論

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)存在于胚胎和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。在成年哺乳動物和晚期胚胎中，NSCs存在的部位和數(shù)量都較少，而在早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs則廣泛存在。因此取孕13～15d胚鼠皮質(zhì)組織和孕11～13d胚鼠中腦組織培養(yǎng)都應(yīng)該較易獲得大量高純度的NSCs。

神經(jīng)干細胞具有自我更新和多向分化潛能，這就為PD的移植治療提供了可能的供體，在對PD的干細胞移植治療中, 移植細胞的數(shù)量及多巴胺能神經(jīng)元的分化比率是必須解決的問題。但自然狀態(tài)下神經(jīng)干細胞分化為多巴胺神經(jīng)元的比例只占細胞總數(shù)的0.5%～5%[6]，因此, 簡便而又有效的神經(jīng)干細胞的體外增殖與多巴胺能神經(jīng)元的大量定向誘導分化是解決問題的關(guān)鍵所在。誘導方式及誘導劑的選擇相當重要，在對多巴胺能神經(jīng)元的體外誘導研究中，細胞因子的作用一直備受關(guān)注。IL-1是一種發(fā)現(xiàn)于造血系統(tǒng)的致炎因子，最初發(fā)現(xiàn)它對造血細胞的分化有重要影響。后來，發(fā)現(xiàn)其也存在于早期發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，這使人們開始探討它對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用。Ling等[4]考查了18種不同的細胞因子對大鼠胚胎中腦的細胞誘導作用，在受試所有因子中僅有IL-1(包括α和β)能夠誘導產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元標記物酪氨酸羥化酶(TH)。所以誘導劑的選擇也是至關(guān)重要的。本實驗用IL-1β作誘導劑，分化率為14%，是對照組的6倍多，證實了IL-1對神經(jīng)干細胞分化的誘導作用。

神經(jīng)干細胞的來源對分化的神經(jīng)元最終表型有很重要的影響。Potter等[7]發(fā)現(xiàn)IL-1不能誘導紋狀體來源的神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元，卻能誘導中腦來源的神經(jīng)干細胞。表明不同來源的NSCs特性并不相同，即NSCs的區(qū)域特異性[8]，中腦來源的神經(jīng)干細胞易分化為多巴胺能神經(jīng)元可能是因為來自中腦腹側(cè)的神經(jīng)干細胞本身含有中腦源性轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)發(fā)育信號，能夠?qū)^(qū)域性的相關(guān)分子信號作出快速反應(yīng)，從而分化為多巴胺能神經(jīng)元。我們在實驗中選擇中腦來源的神經(jīng)干細胞顯然有利于誘導，因此，實驗組和對照組均能檢測到TH陽性細胞，只是實驗組的TH陽性細胞數(shù)量比對照組的多。而我們對皮質(zhì)來源的神經(jīng)干細胞均未檢測到TH陽性細胞。

在本實驗中，我們對皮質(zhì)與中腦源神經(jīng)干細胞向DA能神經(jīng)元定向誘導分化能力和差異進行了初步探討。目前IL-1β促進中腦神經(jīng)干細胞向TH 陽性神經(jīng)元分化的作用是肯定的,由于影響調(diào)控干細胞分化的因素和機制復雜，其具體誘導機制目前尚未清楚，有待進一步研究。

[1]Goya RL，Tyers P，Barker RA.The search for a curativecell therapy in Parkinson’S disease[J].J Neurol Sci，2008，265：32-42.

[2]劉兵，劉洪濤，戴冀斌，等. 小鼠胚胎中腦神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)及分化[J]. 長江大學學報：(自然科學版)醫(yī)學卷，2006，3(4)：252-254.

[3]劉兵，歐微，彭超華，等. 胚鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及分化[J]. 長江大學學報：(自然科學版)醫(yī)學卷，2009，6(3)：8-10.

[4] Ling ZD, Potter ED, Lipton JW,etal.Differentiation of mesencephalic progenitor cells into dopaminergic neurons by cytokines[J]. Exp Neuro，1998，149：411-423.

{5}劉兵，劉洪濤. IL-1α誘導中腦神經(jīng)干細胞分化的實驗研究[J]. 長江大學學報：(自然科學版)醫(yī)學卷，2005，2(12)：343-346.

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.01.002

２０１０-０３-０２

湖北省教育廳科研基金項目（Ｑ２０１００３０８）

劉兵（１９７３-），男，湖北鐘祥人，講師，碩士，從事神經(jīng)生物學和斷層解剖學研究。

R338.2

A

1673-1409(2010)01-R003-03