馮俊清，李媛媛，楊揚(yáng)，洪亞輝

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

辣椒白絹病是一種嚴(yán)重的土傳性病害，由病原菌Sclerotium rolfsii Sacc.引起[1－2]。辣椒植株受害初期莖基部呈暗褐色，其上長(zhǎng)出白色絹絲狀菌絲體，呈輻射狀向四周擴(kuò)展，后期病部菌絲和地表菌絲體都可產(chǎn)生褐色白菜籽狀菌核，不久后植株萎蔫落葉死亡[3]。這種病害防治難度大，固而有“南方疫病”之稱。目前關(guān)于辣椒白絹病生物防治的研究較少。因此，尋找生防菌資源,探索控制辣椒白絹病的生物防治途徑，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義[4－6]。木霉菌廣泛存在于土壤中，對(duì)多種植物病原真菌具有拮抗作用，是一類研究得較多的生防資源，能通過競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、抗生作用、誘導(dǎo)抗性等多方面機(jī)制影響土傳病原菌的正常生長(zhǎng)和代謝[7]。

本實(shí)驗(yàn)擬從染病植株中分離辣椒白絹病致病菌、從病害嚴(yán)重區(qū)土壤中分離木霉菌，并研究木霉對(duì)辣椒白絹病的生物防治效果和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

染病辣椒植株采集自醴陵市賀家橋鎮(zhèn)辣椒白絹病重病區(qū)田中，土樣亦從此處采集。

培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基,馬鈴薯汁200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g。

1.2 方法

1.2.1 白絹病致病菌的分離、純化將染病的辣椒植株去掉葉片和部分枝條后置于潮濕陰暗處，用濕毛巾蓋在植株根部。24 h后根部長(zhǎng)出白色絲狀真菌。在超凈工作臺(tái)上用已消毒的鑷子夾取少許菌絲，將真菌絲在鏈霉素溶液中消毒后接種于PDA培養(yǎng)基中，倒置在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。白色菌絲長(zhǎng)滿約1/2培養(yǎng)皿時(shí)，用接種環(huán)挑取菌絲，接種到另一個(gè)PDA培養(yǎng)基中。重復(fù)篩選4次，所得純化的真菌即白絹病致病菌，做好標(biāo)記，并保存。

1.2.2 白絹病致病菌菌核的培養(yǎng)將純化的白絹病致病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中，倒置在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后即得深褐色菌核。

1.2.3 木霉菌的分離、純化將采集到的土樣粉碎，分裝于50 mL的燒杯中，每燒杯裝20 g樣土，灑水少許，使其濕潤(rùn)。將白絹病菌菌核用鑷子夾到小燒杯樣土中，每燒杯15粒。燒杯用黑色塑料膜封口，置于陰暗處。20 d后將菌核從土壤中挑出,接種到PDA培養(yǎng)基上，于28℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。約3 d后在菌核周圍有木霉長(zhǎng)出。木霉長(zhǎng)到1/2個(gè)培養(yǎng)皿大小時(shí)，用接種環(huán)挑取菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上。重復(fù)純化4～5次，將純化的木霉標(biāo)記并保存。

1.2.4 對(duì)峙實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺(tái)上將白絹病致病菌用滅菌后的接種環(huán)接種到PDA培養(yǎng)基平板的一側(cè)，同時(shí)用將木霉接種到PDA培養(yǎng)基的另一側(cè),于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，并觀察記錄抑制效果，用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落半徑，以只接種致病菌的平板作對(duì)照。于平板培養(yǎng)第7天分別計(jì)算13株木酶對(duì)辣椒白絹病致病菌的抑菌率，計(jì)算方法見公式（1）。

抑菌率（%）＝[（對(duì)照菌落半徑-與木霉對(duì)峙培養(yǎng)的菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑]×100[8]（1）1.2.5外界環(huán)境條件對(duì)木霉生長(zhǎng)的影響由對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析，選出一株對(duì)辣椒白絹病致病菌有較強(qiáng)抑制效果的木酶菌，研究外界環(huán)境條件（溫度、培養(yǎng)基pH值、外界光照時(shí)間）對(duì)其生長(zhǎng)狀況的影響。（1）溫度對(duì)木霉生長(zhǎng)影響。將4個(gè)恒溫箱的溫度分別設(shè)定為30、40、50、60℃，再將已接種的PDA平板上置于其中，進(jìn)行倒置培養(yǎng)，觀測(cè)木霉生長(zhǎng)狀況。（2）環(huán)境pH值對(duì)木霉生長(zhǎng)影響。配制不同pH值的PDA培養(yǎng)基，于木霉接種后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行倒置培養(yǎng)，觀測(cè)其生長(zhǎng)狀況。（3）光照強(qiáng)度木霉生長(zhǎng)狀況影響。將待試木霉菌種放置于室外接受陽光直射，光照處理3、6、9 h后，分別接種于平板上進(jìn)行倒置培養(yǎng)，觀測(cè)其生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白絹病致病菌的分離

如圖1所示，在PDA平板培養(yǎng)基上成功得到純化的辣椒白絹病致病菌。病菌菌絲發(fā)達(dá)，白色，有絹絲狀光澤，在基物上呈羽毛放射狀向四周生長(zhǎng)；菌絲有隔，生長(zhǎng)速度快；菌絲細(xì)長(zhǎng)，適應(yīng)能偏酸性環(huán)境。

2.2 白絹病致病菌菌核培養(yǎng)

如圖2所示，致病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，菌絲上開始凝結(jié)，形成很多細(xì)小顆粒狀菌核，初為白色或淡黃色，后變?yōu)楹稚梁诤稚?，呈球形或不?guī)則形，直徑為0.5～3.0 mm。表面平滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，干燥時(shí)外殼極堅(jiān)硬。

圖1 在28℃恒溫箱中培養(yǎng)5天后的白絹病致病菌

圖2 在28℃恒溫箱中培養(yǎng)15天后的白絹病致病菌菌核

2.3 木霉的分離、純化

從采集到的土樣中共分離得到13株木霉菌。木霉生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)初期菌絲白色、半透明，培養(yǎng)5～6 d開始形成孢子，孢子呈淡綠色、淡黃色或綠色。

2.4 對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

由表1可以看出，分離出的木霉菌在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)辣椒白絹病的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，其中7號(hào)和13號(hào)木霉的抑制效果最好，抑菌率分別達(dá)到73.2%和74.1%。

表1 1-13號(hào)木霉與致病菌對(duì)峙實(shí)驗(yàn)抑菌圈半徑

2.5 外界環(huán)境條件對(duì)木霉生長(zhǎng)的影響

2.5.1 溫度對(duì)木霉生長(zhǎng)影響在不同溫度下培養(yǎng)72h，每天定時(shí)測(cè)量菌落直徑，所得木霉生長(zhǎng)數(shù)據(jù)見表2。表2數(shù)據(jù)表明，木霉在30～40℃之間生長(zhǎng)速度較快，生長(zhǎng)狀況較好；在50℃左右雖然生長(zhǎng)速度較慢，但仍然有菌絲體生長(zhǎng)；60℃以上則無生長(zhǎng)。這說明木霉菌具有一定的耐熱性，但是溫度過高會(huì)殺死菌種，使之不能生長(zhǎng)。

2.5.2 環(huán)境pH值對(duì)木霉生長(zhǎng)影響如表3所示，木霉在環(huán)境條件pH值5.0、6.0、7.0時(shí)生長(zhǎng)狀況良好，其中6.0時(shí)生長(zhǎng)速度最快，在pH值變?yōu)?.0時(shí)，生長(zhǎng)速度緩慢。由此可見木霉的最適pH為弱酸性，在弱酸性環(huán)境中會(huì)迅速生長(zhǎng)，堿性環(huán)境會(huì)抑制木霉的生長(zhǎng)。

表2 不同溫度下條件下木霉生長(zhǎng)狀況

表3 不同pH值對(duì)木霉生長(zhǎng)的影響

2.5.3 光照時(shí)間對(duì)木霉生長(zhǎng)的影響如表4所示，光照對(duì)木霉有一定的影響，光照3 h與光照6 h對(duì)木霉的影響基本無差異，但當(dāng)光照時(shí)間達(dá)到9 h后，木霉的生長(zhǎng)受到了抑制。

表4 不同光照時(shí)間對(duì)木霉生長(zhǎng)的影響

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)共分離純化得到13株木霉菌，從對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，分離到的木霉對(duì)白絹病致病菌均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，為進(jìn)一步研究木霉對(duì)白絹病的抑制機(jī)理打下基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木霉是一種較能耐熱、耐酸性菌，當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到50℃時(shí)也能生長(zhǎng)。在中性或偏酸性環(huán)境下，木霉生長(zhǎng)速度極快，在偏堿性的條件下生長(zhǎng)則會(huì)受到抑制。光照強(qiáng)度也是影響木霉生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素，實(shí)驗(yàn)證明，強(qiáng)日光照射6 h不會(huì)對(duì)木霉生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，光照9 h以上時(shí)會(huì)對(duì)木霉起抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠充分證明木霉是一種優(yōu)良的拮抗微生物，在生物防治領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值[10-11]。它能夠在環(huán)境比較惡劣的情況下生長(zhǎng)，能產(chǎn)生多種酶系抑制病原微生物的生長(zhǎng)。木霉生長(zhǎng)迅速，利于同病原菌競(jìng)爭(zhēng)生存空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也可以達(dá)到抑菌的作用。

本實(shí)驗(yàn)只是初步探討了外界環(huán)境對(duì)木霉生長(zhǎng)狀況的影響和木霉對(duì)辣椒白絹病致病菌的抑制效果，今后需要更深入地研究其作用機(jī)制和生物學(xué)特性，以期尋找到更多、更高效、更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株，為木霉生產(chǎn)提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。

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