鄭麗雪，王立梅，梅艷珍，齊 斌*

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母谷胱甘肽的提取條件

鄭麗雪，王立梅，梅艷珍，齊 斌*

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取釀酒酵母胞內(nèi)谷胱甘肽的條件。結(jié)果表明，谷胱甘肽最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)43.7%、乙醇添加量7.03mL/0.1g干酵母粉、抽提時間80min、谷胱甘肽提取率達(dá)最大為9.54mg/g。

谷胱甘肽；乙醇；釀酒酵母；響應(yīng)面分析

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的生物活性三肽化合物，其廣泛分布于動物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，以酵母、小麥胚芽以及人和動物的肝臟、腎、紅細(xì)胞和眼睛晶狀體中含量較為豐富[1-4]。GSH分子中含有一個特異的γ-肽鍵[5]，且半胱氨酸側(cè)鏈基團(tuán)上連有一個活潑的巰基，這些結(jié)構(gòu)決定了其在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。例如，它可以迅速提高機(jī)體免疫力，在抗氧化、抗輻射、消除自由基、解毒、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收等方面具有良好效果，另外，它還具有增強(qiáng)食品營養(yǎng)價值和強(qiáng)化食品風(fēng)味等功能[6-7]。

目前，GSH的生產(chǎn)方法主要有溶劑萃取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法[8]。其中，利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽是最具潛力的方法[9]。但由于GSH為胞內(nèi)產(chǎn)物，采用有效的提取手段使GSH從酵母細(xì)胞內(nèi)溶出十分重要，一些化學(xué)破壁法(酸解、堿解)、物理破壁法(液體剪切、固體剪切)、生物破壁法(酶解、自溶)被廣泛應(yīng)用，這些方法將細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽釋放出來的同時，細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等物質(zhì)也一起釋放出來，不利于后續(xù)的分離工作[10]。抽提液中GSH的分離純化是當(dāng)前研究的技術(shù)難題之一。

本實(shí)驗(yàn)采用低體積分?jǐn)?shù)乙醇可以改變細(xì)胞壁通透性、使細(xì)胞內(nèi)的部分物質(zhì)如谷胱甘肽通過細(xì)胞壁擴(kuò)散到胞外的特點(diǎn)[11]，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對乙醇提取釀酒酵母胞內(nèi)谷胱甘肽的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CS10515-1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

GSH標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)、ALLOXAN試劑(分析純) 美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；3-30K臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司； CHRIST凍干機(jī) 德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 GSH抽提方法

取0.1g干酵母粉置于離心管底部，分別加入體積分?jǐn)?shù)為15%、25%、35%、45%、55%的乙醇溶液，加入量為4～16mL，于30℃振蕩抽提45～105min，4℃離心分離，取上清液1mL測GSH含量。

1.3.2 GSH提取的單因素試驗(yàn)

分別以不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇添加量和抽提時間為因素，考察各因素對GSH提取率的影響，反應(yīng)溫度為30℃。

1.3.3 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面(response surface methodology，RSM)分析法對乙醇提取谷胱甘肽的條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 GSH含量的測定

采用ALLOXAN法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對GSH提取率的影響

分別考察了15%、25%、35%、45%、55%的乙醇對GSH 提取率的影響，其他條件保持不變(乙醇加入量20mL，抽提時間120min(圖1)。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對GSH提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on glutathione yield

由圖1可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，GSH提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)，GSH提取率迅速下降。Xiong等[11]研究發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)25%是提取凍干的高密度發(fā)酵后的酵母細(xì)胞胞內(nèi)GSH最佳體積分?jǐn)?shù)，最高提取率達(dá)到0.31%。25%乙醇可以使GSH順利通過酵母細(xì)胞的三層生物膜即線粒體內(nèi)膜、外膜以及細(xì)胞質(zhì)膜而不破壞細(xì)胞壁[13]。舒媛等[14]等確定50%乙醇能有效地提取濕酵母中GSH，折合成干酵母計(jì)算，最高提取率達(dá)到2.01%。安賢惠[15]研究了提取市售的安琪活性酵母胞內(nèi)GSH，結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)越小，提取酵母中GSH的效果越好，最高提取率為1.15%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，45%乙醇能有效提取胞內(nèi)的GSH，一方面可能由于試驗(yàn)過程中使用的干酵母來源不同，造成試驗(yàn)原料本身的細(xì)胞壁的通透性就有差異；而料液比不同可能是導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果有差異的另一個原因。

2.1.2 乙醇添加量對GSH提取率的影響

考察了45%乙醇的添加量對GSH提取率的影響，添加量分別為4、7、10、13、16mL，抽提時間120min (圖2)。

圖2 乙醇添加量對GSH提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol addition amount on glutathione yield

由圖2可見，乙醇添加量對GSH的提取率影響很大，隨著添加量由4mL增加到7mL，GSH提取率急劇上升，當(dāng)添加量為7mL時，提取率達(dá)到最大，從7mL到10mL時，GSH提取率緩慢下降，二者之間的提取率僅相差0.06mg/g，而添加量從10mL增加到16mL時，GSH提取率又急劇下降?？赡苡捎谠谝掖继砑恿枯^小時，不能完全將細(xì)胞內(nèi)的GSH抽提出來，而添加量較大時，可能是位于酵母細(xì)胞胞膜上的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)暴露出來，將GSH降解，γ-GT是唯一的谷胱甘肽降解酶[16]。

2.1.3 抽提時間對GSH提取率的影響

圖3 抽提時間對GSH提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on glutathione yield

在乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，添加量7mL的前提下，考察了不同抽提時間對GSH提取率的影響，抽提時間分別為40、60、80、100、120min(圖3)。

由圖3可見，抽提時間為40min時，GSH提取率較低，而抽提時間為60、80、100min時，GSH提取率相差不大，80min時達(dá)到最大，而在120min時，GSH提取率又急劇下降。這與 Xiong等[11]得出最佳提取時間為60min基本相符。由于乙醇在細(xì)胞內(nèi)溶解了包括GSH在內(nèi)的一些物質(zhì)后，細(xì)胞內(nèi)溶液濃度顯著提高，使細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)濃度差和滲透壓差，細(xì)胞內(nèi)高濃度的溶液不斷向低濃度方向擴(kuò)散，而45%乙醇為稀溶液，由于滲透壓的作用，又不斷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以平衡其滲透壓，但經(jīng)一定時間后，擴(kuò)散達(dá)到平衡時，時間就不再起作用。所以在40～80min時，抽提量和時間呈正比，而抽提時間超過80min時，由于GSH不穩(wěn)定導(dǎo)致其提取率的下降[15]。

2.2 響應(yīng)面法對乙醇提取釀酒酵母中谷胱甘肽條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以GSH提取率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步進(jìn)行三因素三水平的RSM分析試驗(yàn)。編碼與因子對應(yīng)關(guān)系見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

表2 Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及GSH提取率Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values of glutathione yield

運(yùn)用SAS程序?qū)貧w方程進(jìn)行方差分析(表3)。分析結(jié)果表明，X1、X12、X22、X32項(xiàng)對GSH提取率影響極顯著，由此所建立的模型也是極顯著；其他項(xiàng)影響不顯著。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis for fitted regression model

圖4 Y=(X2,X3)的響應(yīng)面分析圖Fig.4 Response surface plot of glutathione yield as a function of amount of added ethanol and extraction time

圖5 Y=(X1,X3)的響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface plot of glutathione yield as a function of ethanol concentration and extraction time

圖6 Y=(X1,X2)的響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface plot of glutathione yield as a function of ethanol concentration and amount of added ethanol

從圖4～6可以直觀地看出，各因素對響應(yīng)值的影響變化趨勢。以GSH提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用SAS程序進(jìn)行回歸擬合后回歸方程如下：

對回歸方程求解得：X1=－0.253、X2=0.013、X3=－0.010，即當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)43.7%、乙醇添加量7.03mL/ 0.1g干酵母粉、抽提時間80min時，GSH提取率為9.54mg/g。3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值擬合較好，說明回歸方程為胞內(nèi)GSH的提取提供了一個合適的模型。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了乙醇提取釀酒酵母中GSH的最佳條件，最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)43.7%、乙醇添加量7.03mL/0.1g干酵母粉、抽提時間80min，GSH提取率為9.54mg/g。通過對預(yù)測模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值基本一致，說明模型能較好的反應(yīng)實(shí)際情況。

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Optimization of Glutathione Extraction from Saccharomyces cerevisiae Using Response Surface Methodology

ZHENG Li-xue，WANG Li-mei，MEI Yan-zhen，QI Bin*
(College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Box-Behnken design and response surface methodology were applied to maximize the glutathione yield from Saccharomyces cerevisiae extracted with alcohol. Results showed that the optimum conditions of glutathione extraction were as follows: ethanol concentration 43.7%, amount of added ethanol 7.03 mL/ 0.1 g yeast powder and extraction time 80 min. Under such optimal conditions, a maximal glutathione yield of 9.54 mg/g were obtained.

glutathione；ethanol；Saccharomyces cerevisiae；response surface analysis

TQ926.4

A

1002-6630(2010)10-0060-04

2009-08-01

蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(YJG0913)；江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目

鄭麗雪(1982—)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lixue9418@163.com

*通信作者：齊斌(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程。 E-mail：qibin65@126.com