鄒建國，劉 飛，徐小龍，劉燕燕，彭海龍，王海鵬，羅 平

(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

微波輔助提取馬錢子中總生物堿工藝

鄒建國，劉 飛，徐小龍，劉燕燕，彭海龍，王海鵬，羅 平

(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

采用微波輔助方法提取馬錢子中總生物堿，并對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化?？疾煳⒉ㄝ椛涔β?、微波輻射時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和微波前預(yù)浸泡時(shí)間等因素對提取效率的影響，并利用響應(yīng)面法對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。利用中心組合設(shè)計(jì)原理及響應(yīng)面法分析建立二次回歸模型，以微波輻射功率、微波輻射時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以士的寧、馬錢子堿產(chǎn)率的綜合指標(biāo)為響應(yīng)值，研究各因素及其交互作用對生物堿產(chǎn)率的影響。利用模型的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，確定微波輔助提取馬錢子中生物堿的最佳工藝參數(shù)：微波功率240W、微波輻射時(shí)間6.7min、液料比6:1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)58.8%。在此條件下，士的寧、馬錢子堿的提取量分別達(dá)到18.97、9.46mg/g，與理論預(yù)測值基本吻合。該結(jié)果可為馬錢子中總生物堿的工業(yè)提取提供參考和依據(jù)。

馬錢子；微波輔助提?。豢偵飰A；響應(yīng)面法；響應(yīng)值

馬錢子為馬錢科植物馬錢(Strychnos nux-vomica L.)或云南馬錢 (Strychnos pierriana A.W.Hill)的干燥成熟種子。馬錢子在我國藥用歷史悠久，其性苦味溫，歸肝脾經(jīng)，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效[1-4]。臨床上主要用于風(fēng)濕頑痹、跌打損傷、小兒麻痹后遺癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、慢性支氣管炎和慢性再生障礙性貧血等的治療[5-8]。馬錢子藥用有效成分為生物堿類，含量為1.5%～5%，其中主要是士的寧，其次是馬錢子堿[9-10]。因此，提取分離馬錢子生物堿的技術(shù)研究，對進(jìn)一步開發(fā)馬錢子藥用價(jià)值和提高其經(jīng)濟(jì)效益均具有重要意義。

微波輔助提取技術(shù)利用微波能所產(chǎn)生的破壁效應(yīng)，可將存在于植物細(xì)胞內(nèi)的活性成分較完全的釋放出來，具有強(qiáng)力、瞬時(shí)、高效、溶劑用量小、萃取效率高等特點(diǎn)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)將微波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于馬錢子中生物堿的提取，通過單因素和響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化微波

輔助提取馬錢子中生物堿的工藝條件，為微波輔助提取馬錢子中生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

馬錢子(經(jīng)南昌大學(xué)制藥工程教研室蔣以號博士鑒定)樟樹市醫(yī)藥公司市售；士的寧(批號:110705-200306)標(biāo)準(zhǔn)品、馬錢子堿(批號:0706-200104)標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；其余試劑均為分析純。

MCL-3型微波提取裝置 四川大學(xué)無線電系改裝；LC-10AT型高效液相色譜儀 日本島津公司；FZ-102微型植物粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；FA2104型電子天平 上海倫捷機(jī)電儀表有限公司；TDL-4型離心機(jī) 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；SHB-ⅢB型循環(huán)水式真空泵 上海儀表集團(tuán)供銷公司；SENCO型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微波輔助提取馬錢子中總生物堿

精密稱取經(jīng)粉碎、篩分、干燥的馬錢子生品5.0g，置100mL圓底燒瓶中，加入一定量的提取劑，預(yù)浸泡一定時(shí)間后，在給定的實(shí)驗(yàn)條件(微波功率、微波提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)等)下，微波輔助提取馬錢子中總生物堿。提取液經(jīng)過濾，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液定容至100mL。準(zhǔn)確吸取該提取液10mL，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，用2倍量無水乙醇溶解樣品，低速離心機(jī)2000r/min離心20min，取上清液，用無水硫酸鈉脫水，過濾，無水乙醇定容至25mL。用0.45μm濾膜過濾后供HPLC檢測，計(jì)算出生物堿提取量。

通過單因素試驗(yàn)，分別考察樣品粒徑、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑pH值、微波前預(yù)浸泡時(shí)間、微波功率和微波提取時(shí)間等因素對馬錢子中總生物堿提取效率的影響，初步選定其最佳工藝條件。再在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波功率、微波提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)三個(gè)對馬錢子有效成分提取效果影響較大的因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 分析檢測方法

1.2.2.1 色譜條件

Shimadzu VP-ODS色譜柱(150mm×4.6mm，4.6μm)；檢測波長：254nm，柱溫：30℃，流動(dòng)相：A(78%)為水-乙酸-三乙胺(230:2.4:0.3)；B(22%)為甲醇；流速：1.0mL/min，收集時(shí)間：25min。在該色譜條件下士的寧和馬錢子堿的保留時(shí)間分別為9.5min和13.2min。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至質(zhì)量恒定的士的寧、馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品7.1mg和6.5mg，移入25mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得混合對照品溶液。分別取該標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10μL準(zhǔn)確進(jìn)樣，以色譜峰面積(Y)和進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸。

1.2.2.3 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述對照品溶液5μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算其RSD值。

采用加樣回收法，精密量取已知含量的樣品3份，加入對照品溶液適量，按樣品測定項(xiàng)下方法操作，計(jì)算回收率。

1.2.3 工藝評價(jià)指標(biāo)

多指標(biāo)綜合評判不拘泥于某化學(xué)成分或適合純化學(xué)成分的藥理模型，而是考慮綜合成分作用，并進(jìn)行優(yōu)選工藝。按照中心組合設(shè)計(jì)表的條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別測得士的寧、馬錢子堿提取量，并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。評分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的統(tǒng)計(jì)權(quán)重[13]。在本實(shí)驗(yàn)中其權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.5。其工藝評價(jià)指標(biāo)如下式所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 分析檢測結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品、供試品HPLC色譜圖，見圖1、2。以標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積(Y)和進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸得出士的寧和馬錢子堿的回歸方程，見表1。精密度實(shí)驗(yàn)計(jì)算出RSD分別為：士的寧1.21%，馬錢子堿1.33%，都小于2%，表明儀器精密度良好。回收率實(shí)驗(yàn)表明：士的寧和馬錢子堿的平均回收率分別達(dá)到98.24%和97.60%(表2)。

表1 士的寧和馬錢子堿的回歸方程Table 1 Standard equations of strychine and brucine

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of strychine and brucine standards

圖2 供試品HPLC色譜圖Fig.2 Chromatograms of the extract from Semen Strychni

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Spike recoveries for strychine and brucine (n=3)

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)條件，在影響馬錢子有效成分提取的工藝條件中，初步選定馬錢子粒度20～40目，液料比(mL/g)6:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，微波前預(yù)浸泡時(shí)間30min，微波輻射功率240W，微波輻射時(shí)間6.0min作為最佳提取條件。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels in the central composite design

表4 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 4 Central composite design matrix and experimental results

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，精密稱取5.0g馬錢子樣品于圓底燒瓶中，選取微波功率(X1)、微波提取時(shí)間(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)對馬錢子有效成分提取量影響顯著的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化馬錢子中生物堿的提取工藝，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3、4。

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

將上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三元非線性回歸分析，可得如下回歸方程：

Y = 99.24+1.329X1+4.513X2+0.4862X3－1.393X1X2－0.255X1X3+1.733X2X3－13.75X12－7.005X22－1.562X32

表5 回歸模型各項(xiàng)的方差分析Table 5 Analysis of variances for each term of the developed regression model

回歸方程中各因子與響應(yīng)值之間線性關(guān)系的顯著性，可由F值檢驗(yàn)來判定。從表5可以看出，各因素中X1、X2、X12、X22為顯著性(P＜0.05)影響因素。在各單因素中，微波提取時(shí)間(X2)對響應(yīng)值的影響最大，其次是微波功率(X1)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)。模型的F=55.49＞F0.01(9,5)，表明該回歸方程具有高度的顯著性，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9901，說明響應(yīng)值的變化有99.01%來源于所選因素。失擬項(xiàng)F值為5.277，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著。因此，該模型能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，可以用此模型對馬錢子中生物堿的提取效果進(jìn)行分析[14]。

2.3.3 提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

圖3～5直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。比較3組圖可知：微波功率、微波提取時(shí)間對馬錢子提取效果的影響最為顯著，曲線較陡；而乙醇體積分?jǐn)?shù)對響應(yīng)值的影響較小，曲線較為平滑，其數(shù)值的增加或減少，對響應(yīng)值變化較小。

通過對回歸方程求一階偏導(dǎo)，可以求出模型的極值點(diǎn)為微波功率243.2W、提取時(shí)間6.727min、乙醇體積分?jǐn)?shù)58.84%。但考慮到實(shí)際操作和節(jié)省能源將馬錢子提

取工藝條件調(diào)整為微波功率240W、提取時(shí)間6.7min、乙醇體積分?jǐn)?shù)58.8%。在此條件下，實(shí)際測得士的寧、馬錢子堿的提取量平均值分別達(dá)到18.97mg/g和9.46mg/g，綜合指標(biāo)為100.5，與理論預(yù)測值基本吻合，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的微波輔助提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

圖3 Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of Y=f(X1,X2)

圖4 Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots ofY=f(X1,X3)

圖5 Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of Y=f(X2,X3)

2.4 微波輔助提取與熱回流提取技術(shù)的比較

按實(shí)驗(yàn)得到的微波輔助提取最佳工藝條件進(jìn)行馬錢子有效成分的提取實(shí)驗(yàn)，并與熱回流提取[15]實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比，結(jié)果如表6所示。

表6 微波輔助提取與熱回流提取方法比較Table 6 Comparisons on strychnine and strychnine yields and processconditions between this method and hot reflux extraction

由表6可知：微波輔助提取的士的寧提取量與熱回流提取相差不大，而馬錢子堿提取量則高于熱回流提取過程，具有提取效率高，提取劑用量省，提取時(shí)間大大縮短等優(yōu)勢。從節(jié)能、省時(shí)和溶劑消耗等多方面來看，微波輔助提取工藝更適于馬錢子中生物堿的提取。

3 結(jié) 論

3.1 將微波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于馬錢子中生物堿的提取，通過單因素和響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取馬錢子中生物堿工藝條件，其最佳工藝參數(shù)為：微波功率240W、微波輻射6.7min、液料比6:1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)58.8%。在此條件下，士的寧、馬錢子堿提取量分別為18.97mg/g和9.46mg/g。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果可為該技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

3.2 與傳統(tǒng)熱回流提取技術(shù)相比，微波輔助提取馬錢子中總生物堿技術(shù)具有提取效率高，提取劑用量少，提取時(shí)間短，能源消耗低等特點(diǎn)。

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Optimization of Microwave-assisted Extraction of Total Alkaloids from Semen strychni

ZOU Jian-guo，LIU Fei，XU Xiao-long，LIU Yan-yan，PENG Hai-long，WANG Hai-peng，LUO Ping
(School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

Microwave was applied to the extraction of total alkaloids from semen Strychni, the dry ripe seeds of Strychnos nuxvomica L. and the extraction process was optimized in this study. Firstly, single factor studies were conducted to investigate the effects of microwave power and irradiation time, ethanol concentration, liquid/solid ratio and pre-microwave irradiation soaking time on total alkaloids yield. Subsequently, central composition design and multiple nonlinear regression analysis were employed to establish a mathematical model describing total alkaloids yield as a function of the above extraction conditions. Finally, the pairwise interactive effects of these extraction conditions on total alkaloids yield were examined based on response surface and contour plots. The optimal extraction conditions were determined as follows: microwave power 240 W, extraction time 6.7 min, liquid/solid ratio 6:1, ethanol concentration 58.8%. An experimental strychnine yield of 18.97 mg/g and an experimental brucine yield of 9.46 mg/g were obtained under such conditions, which were substantially consistent with their respective theoretical counterparts.

Semen strychni；microwave-assisted extraction；total alkaloids；response surface methodology；response value

R284.2；Q946.91

A

1002-6630(2010)18-0116-04

2010-06-29

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007GZH1924)

鄒建國(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榫?xì)化工、天然產(chǎn)物有效成分的提取與分離。E-mail：Jianguozou@163.com