武 蕓，鄭小江*，卜貴軍，曾 智

(湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化海金沙草多糖的提取工藝

武 蕓，鄭小江*，卜貴軍，曾 智

(湖北民族學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

利用響應(yīng)面分析法對海金沙草多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上選取試驗因素與水平，根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗設(shè)計原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定各工藝條件的影響因素，以海金沙多糖提取率為響應(yīng)面和等高線，在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出海金沙多糖浸提的最佳工藝條件為溫度92℃、料液比1:25、浸提時間2.1h。在最佳提取條件下，提取2次，海金沙草的多糖得率為16.475%。

海金沙；多糖；提??；響應(yīng)面分析法

海金沙草是蕨類植物海金沙科(Lygodiaceae)海金沙屬(Lygodium)多年生蕨類植物海金沙(Lygodium japonicum (Thunb.))的地上部分[1-2]，全草或者成熟孢子入藥，味甘淡，性寒，有清熱解毒，利水通淋的功效，為治療尿路感染、尿路結(jié)石、濕熱腫滿、腎炎水腫、腸炎痢疾、皮膚濕疹、咽喉腫痛等癥的常用中藥[3]。海金沙在臨床上用于治療扁桃體炎、乳腺炎、丹毒、帶狀皰疹、胃脘疼和嬰兒腹瀉等癥狀[4]，并已作為一種中草藥應(yīng)用于防治腫瘤等疾病。海金沙多糖是海金沙的有效成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)與生物活性研究表明，許多植物多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、影響造血系統(tǒng)、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等作用。臨床上和畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。在臨床上，多糖具有安全性高、副作用小、適用面廣、對機(jī)體損害小、即可注射又可服用等優(yōu)點，海金沙多糖對普通變形桿菌和稻瘟病病原菌有較強(qiáng)的抑制活性[5]，因此，將海金沙多糖開發(fā)為天然藥物免疫促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于疾病防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，海金沙多糖具有多種生物學(xué)功能，將其開發(fā)應(yīng)用于飼料添加劑，對減少抗生素等藥物添加劑在飼料中的使用，保證畜產(chǎn)品安全和我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，對海金沙多糖提取工藝的研究很少，本研究采用熱水浸提法對海金沙多糖的提取進(jìn)行單因素試驗，應(yīng)用響應(yīng)面法來確定海金沙多糖的最佳提取工藝，具有試驗周期短，求得回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[6-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海金沙草采自湖北民族學(xué)院校園。

95%乙醇、無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖等(所有試劑均為分析純) 恩施州人合科貿(mào)有限責(zé)任公司；所用水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

植物樣品粉碎機(jī)、756MC-紫外分光光度計、HWS12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；DGX型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SZ-93雙重蒸餾水器 上海亞榮生化儀器廠；FA1004電子天平。

1.3 海金沙多糖熱水提取

多糖提取工藝流程：稱樣品(1.0g) →用熱水提取→離心取上清液，并定容到50mL→取5mL上清液加無水乙醇20mL于4℃過夜→5000r/min離心去除上清液，將沉淀物溶解并定容到10mL→取5mL溶液去蛋白質(zhì)→取2mL溶液測其吸光度。

1.4 去除蛋白質(zhì)

采用Sevag試劑來除蛋白質(zhì)：將樣品、三氯甲烷、正丁醇按25:5:1的比例混合并振蕩20min，然后5000r/min離心15min，取上清液即可。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品17mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得葡萄糖對照品貯備液。

每管加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和雙蒸水后立即混勻，待各管都加入苯酚試劑后，迅速搖勻，然后迅速加入濃硫酸5mL于各試管中搖勻，之后置于40℃水浴中，準(zhǔn)確加熱15min后，立即取出置于流水中冷卻10min。再取出所有試管用1cm口徑的比色皿，以第一管為空白，迅速測定其余各管的吸光度。以糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、吸光度(A480nm)為縱坐標(biāo)，繪出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程：y=0.7940x－0.0304，R2=0.9990。

1.6 多糖得率計算

按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得多糖含量[10]。多糖含量與原料樣品比值為多糖得率。

1.7Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理[11]，綜合單因素試驗結(jié)果，選取提取溫度、料液比、浸提時間對海金沙多糖提取率影響顯著的三個因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗設(shè)計(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Variables and levels in the response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 浸提時間對海金沙多糖提取率的影響

精確稱取5份海金沙樣品粉末各1.0g，在溫度80℃、料液比1:20條件下，各樣品分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，提取1次，結(jié)果見表2。從多糖得率和節(jié)約的角度綜合考慮提取2h比較適宜。

表2 浸提時間對多糖提取率的影響Table 2 Effect of extraction duration on polysaccharide yield

2.1.2 料液比對海金沙多糖提取率的影響

料液比對提取率具有重要的影響，水量多有利于多糖的擴(kuò)散傳質(zhì)，但水量過多會增加蒸發(fā)處理的困難。固定溫度80℃、各樣品分別按料液比1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，提取2.0h，結(jié)果表明(表3)：在料液比1:25、1:30、1:35時，多糖得率很相近，因此選取料液比1:25較好。

表3 料液比對多糖提取的影響Table 3 Effect of solid/liquid ratio on polysaccharide yield

2.1.3 溫度對海金沙多糖提取率的影響

研究溫度對多糖提取率的影響：料液比1:25、分別在60、70、80、90、100℃提取2.0h，提取1次，結(jié)果(表4)顯示：溫度為90℃時多糖得率最高。

表4 溫度對多糖提取率的影響Table 4 Effect of temperature on polysaccharide yield

2.1.4 提取次數(shù)對海金沙多糖提取率的影響

提取次數(shù)決定操作的成本，操作次數(shù)越多，成本

也就越高，且工藝用水量大。在浸提時間2.0h、溫度80℃、料液比1:25條件下，提取4次，結(jié)果(表5)顯示：提取兩次以后多糖得率很少，從節(jié)約時間和能源的角度考慮可以忽略不計。綜上所述，單因素試驗表明：熱水提取海金沙多糖的最佳溫度90℃，提取時間2.0h，料液比1:25，多糖得率最高，提取次數(shù)為兩次可以提取較徹底。

表5 浸提次數(shù)對多糖提取率的影響Table 5 Effect of extraction number on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化海金沙多糖提取工藝條件

2.2.1Box-Benhnken中心組合試驗

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Response surface design arrangement and experimental results

表7 3次試驗所得多糖提取率平均值的響應(yīng)值估計回歸系數(shù)結(jié)果Table 7 Estimated regression coefficient and significance of each term of the developed regression equation with polysaccharide yield as a function

以3次試驗所得多糖提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，試驗設(shè)計與結(jié)果見表6(其中15個試驗中，1～12是析因試驗，13～15是中心試驗，用來估計試驗誤差)。所得結(jié)果用響應(yīng)面分析軟件分析，結(jié)果顯示：溫度、料液比、浸提時間的一次方及其二次方以及浸提時間和料液比對海金沙多糖的提取率影響都極顯著(P＜0.01)，溫度與浸提時間的0.01＜P＜0.05，對海金沙多糖的提取率影響顯著。

通過軟件分析得到海金沙多糖得率為響應(yīng)值的最優(yōu)方程為：

表8 回歸方程的方差分析Table 8 Analysis of variances for polysaccharide yield with various extraction conditions

由表8可知，各因素線性及二次項對響應(yīng)值的影響都是極顯著的。同時可以看出，回歸方程也是極顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=55.3038/55.5676=0.9953，說明響應(yīng)值(提取率)的變化有99.53%來源于所選變量，即溫度、料液比、浸提時間。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件。

2.2.2 各因素間的交互作用

根據(jù)以上回歸方程，利用Design-Expert軟件作不同因素的響應(yīng)面分析圖(圖1～3)。

圖1 浸提溫度(X1)和料液比(X2)對海金沙多糖得率的影響Fig.1 Response surface plot of polysaccharide yield as a function of extraction temperature and solid/liquid ratio

圖2 浸提溫度(X1)和浸提時間(X3)對海金沙多糖得率的影響Fig.2 Response surface plot of polysaccharide yield as a function of extraction temperature and duration

圖3 浸提時間(X3)和料液比(X2)對海金沙多糖得率的影響Fig.3 Response surface plot of polysaccharide yield as a function ofextraction duration and solid/liquid ratio

從圖1～3可以直觀看出，各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，以確定最佳因素水平范圍。根據(jù)以上Box-Benhnken的中心組合試驗，得到海金沙的最佳提取工藝條件為：溫度92℃、料液比1:25、浸提時間2.1h。

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得如下3式：

由式(1)(2)(3)得知，X1=0.196，X2=0.070，X3=0.198，對應(yīng)真實值為浸提溫度91.96℃、料液比1:25.35、浸提時間2.099h。但考慮到實際操作的便利，將海金沙多糖的最佳提取條件修正為提取溫度92℃、料液比1: 25、浸提時間2.1h。

2.3 驗證實驗

精確稱取三份海金沙草干粉1.0g于三角瓶中，加入25mL蒸餾水，在92℃水浴中加熱2.1h，提取1次，測得其多糖平均得率為13.439% ；第2次提取，多糖平均得率為3.036(表10)，與上述試驗所得結(jié)果比較接近，這說明試驗擬合情況較好，實驗誤差小。因此，該分析方法符合實驗要求，可以用來作為優(yōu)化多變量系統(tǒng)的有效試驗工具。

表9 驗證實驗結(jié)果Table 9 Verification of optimal extraction conditions for water-soluble polysaccharides from the shoot of Lygodium japonicum

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗設(shè)計原理，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取溫度、料液比和浸提時間對海金沙草多糖提取的工藝條件。結(jié)果表明，海金沙草多糖浸提的最佳工藝條件為溫度92℃、料液比1:25、浸提時間2.1h。在最佳提取條件下，浸提2次，海金沙草的多糖得率為16.475%。

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Extraction Optimization of Water-soluble Polysaccharides from the Shoot of Lygodium japonicum Using Response Surface Methodology

WU Yun，ZHENG Xiao-jiang*，BU Gui-jun，ZENG Zhi
(Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Based on single factor studies, a three-variable, three-level Box-Benhnken experimental design and response surface methodology were employed to optimize the extraction process of water-soluble polysaccharides from the shoot of Lygodium japonicum. Response surface and contour plots with polysaccharide yield as a function were obtained, and process conditions were analyzed for their significance for polysaccharide extraction and significance analysis of their interactions was also done. Extraction temperature of 92 ℃ and solid/liquid ratio of 1:25 for twice extraction for 2.1 h each time were found optimal. Under such conditions, a polysaccharide yield of 16.475% was obtained.

Lygodium japonicum；polysaccharide；extraction；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2010)18-0108-04

2010-06-18

國家民委科研項目(08HB04)；湖北省科技廳創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2009CDA155)；2010年恩施州科技指導(dǎo)項目

武蕓(1971—)，女，講師，碩士，主要從事植物及天然產(chǎn)物開發(fā)研究。E-mail：wuyun2058@sohu.com

*通信作者：鄭小江(1958—)，男，教授，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：hbzxj123@126.com