蘇 玨，賀新生*，竹文坤

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

柏樹火焰層孔菌菌絲體發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

蘇 玨，賀新生*，竹文坤

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

柏樹火焰層孔菌是中國以及亞洲菌物的新記錄屬中的新記錄種，是一種稀有的藥用菌。為尋求高產(chǎn)的生長條件和經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)速、溫度、pH值、培養(yǎng)液裝瓶體積、接種量、碳源、氮源、C/N對(duì)菌絲體生長影響的單因素試驗(yàn)和多因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用液體培養(yǎng)基探索這些條件對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：菌絲生長最適碳源為淀粉，最適氮源為麩皮，P、K、Mg對(duì)菌絲的生長具有促進(jìn)作用，最適C/N為20:1～25:1；菌絲生長的最適轉(zhuǎn)速為150r/min，溫度為25～30℃，最佳pH值為5～7，最適培養(yǎng)液裝瓶體積為100mL，最適接種量為8mL/100mL。液體培養(yǎng)基的最佳營養(yǎng)條件為：葡萄糖 25g/L、麩皮 125g/L、 K2HPO40.25g/L、pH 6.5。通過生長曲線實(shí)驗(yàn)得到Logsitic方程為：y= 0.22/(1+ 1.019e-0.013x)。

柏樹火焰層孔菌；液體發(fā)酵；菌絲體產(chǎn)量

柏樹火焰層孔菌(Pyrofomes demidoffii (L é v.) Kotl.& P o u z a r)分類學(xué)地位屬菌物界(F u n g i)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，火焰層孔菌屬(Pyrofomes Kotl. & Pouzar)[1]。全球記載該屬有7種。柏樹火焰層孔菌主要分布于中歐、非洲和北美，該菌特異性著生于刺柏屬(Juniperus L.)樹木，會(huì)造成樹木的白色心材腐朽病[2-4]。

Dai等[5]于2006年在四川臥龍大熊貓自然保護(hù)區(qū)采集到該菌的子實(shí)體，分離得到了純菌種，鑒定為柏樹火焰層孔菌，是中國和亞洲的新記錄屬中的新記錄種。該菌菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC NO:1932。柏樹火焰層孔菌是一種稀有的藥用真菌，當(dāng)?shù)厝罕姲言摼淖訉?shí)體當(dāng)成抗癌藥物長期使用。為探索該菌的生物學(xué)特性，本實(shí)驗(yàn)采用液體培養(yǎng)方法對(duì)柏樹火焰層孔菌的菌絲體生長特性進(jìn)行研究[6]。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

柏樹火焰層孔菌野生子實(shí)體采集于臥龍大熊貓自然保護(hù)區(qū)2棵有5 00年以上樹齡的刺柏 (J un ip e ru s formosana Hayata) 樹干上，共生長了10多個(gè)子實(shí)體，采集日期為2006年8月23日，組織分離得到純菌種。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基； 種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基去掉瓊脂、MgSO4·7H2O 0.5g、K2HPO41.0g、KH2PO40.46g；液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蛋白胨2g、MgSO4·7H2O 0.5g、K2HPO40.1g、KH2PO40.46g。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

將保存的菌種接到斜面培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)8d。取活化菌種1cm2左右接入裝有150mL種子液培養(yǎng)基的250mL輸液瓶中，于25℃、150r/min條件下培養(yǎng)10d。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 碳源對(duì)菌絲體生長的影響

以2g/L蛋白胨為氮源，分別用葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、木糖、甘露醇、山梨醇、纖維素鈉、木質(zhì)素作碳源，用量均為20g/L，重復(fù)3次。250mL輸液瓶裝100mL液體培養(yǎng)基，等量接種，置旋轉(zhuǎn)式搖床150r/min，25℃振蕩培養(yǎng)10d。以下單因素試驗(yàn)培養(yǎng)條件與此相同。

1.3.2.2 氮源對(duì)菌絲體生長情況的影響

以20g/L的葡萄糖為碳源，每1000mL培養(yǎng)基分別用蛋白胨2g、酵母浸膏5g、硝酸鉀3.7g、硝酸銨1.7g、氯化銨1.5g、硫酸銨2g、尿素1g、干酪素2g、麩皮50g、玉米粉75g、米糠75g作氮源，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.3 無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長情況的影響

以2g/L的蛋白胨為氮源，20g/L的葡萄糖為碳源，分別設(shè)硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸鋅、硫酸鈣、硫酸鉀、磷酸二氫鈉6個(gè)處理，用量均為0.5g/L，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.4 C/N比對(duì)菌絲體生長情況的影響

以20g/L葡萄糖為碳源，固定用量。蛋白胨為氮源，使培養(yǎng)液的C/N為35:1～5:1，級(jí)差為5，共7個(gè)處理，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體生長情況的影響

以最適碳源和氮源分別代替發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖和蛋白胨配制培養(yǎng)基(下同)。接種后分別放入90、110、130、150、170、190r/min的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為25℃，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.6 溫度對(duì)菌絲體生長情況的影響

250mL輸液瓶裝100mL配制的培養(yǎng)液。接種后分別放入15、20、25、30、35℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.7 pH值對(duì)菌絲體生長情況的影響

將配制好的培養(yǎng)液調(diào)節(jié)pH值分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、1 0，然后分別進(jìn)行分裝，裝液量為100mL，接種，150r/min搖床培養(yǎng)，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.8 培養(yǎng)液裝瓶體積對(duì)菌絲體生長情況的影響

將配制好的培養(yǎng)液分裝成60、80、100、120、140、160mL于250mL的輸液瓶中，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.9 接種量對(duì)菌絲體生長情況的影響

在輸液瓶中分裝100mL配制好的培養(yǎng)液。接種量設(shè)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL/瓶10個(gè)梯度，重復(fù)3次取平均值。

1.3.3 多因素試驗(yàn)

采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選擇篩選出的碳源、氮源、K2HPO4、pH值4個(gè)因素，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1 0，共9個(gè)處理，重復(fù)3次取平均值。

1.3.4 生長曲線實(shí)驗(yàn)

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量為100mL，滅菌等量接種，150r/min、25℃振蕩培養(yǎng)，每24h測菌體干質(zhì)量，重復(fù)3次取平均值。

1.3.5 指標(biāo)測定

菌絲球個(gè)數(shù)：用計(jì)數(shù)器記錄所有菌球個(gè)數(shù)。

菌絲球直徑：取發(fā)酵液用水稀釋10倍，隨機(jī)取20個(gè)菌球在培養(yǎng)皿中排成一行，用游標(biāo)卡尺測定總長度，重復(fù)3次，求其平均值。

菌絲體干質(zhì)量：收取的發(fā)酵液用雙層紗布過濾得菌絲球，用蒸餾水沖洗3次后于60℃下烘干至質(zhì)量恒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌絲體生長的影響

由表1可知，對(duì)菌絲體產(chǎn)量方差分析(DPS 6.01軟件，下同)得到，F(xiàn)=12.6440，P＜0.01，差異極顯著，表明菌株在不同碳源條件下培養(yǎng)，菌絲體產(chǎn)量有顯著變化。菌絲體在淀粉中長勢最好，其次分別是葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、木糖、木質(zhì)素、山梨醇、乳糖，最差的是纖維素鈉。

2.2 氮源對(duì)菌絲體生長的影響

由表2可知，對(duì)菌絲體產(chǎn)量進(jìn)行方差分析得到

F=20.75，P＜0.01，差異極顯著，表明菌株在不同氮源條件下培養(yǎng)，菌絲體產(chǎn)量有顯著變化。柏樹火焰層孔菌在各種氮源中均能生長，在麩皮中長勢最好，其次分別是米糠、尿素、干酪素、蛋白胨、玉米粉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、酵母膏和氯化銨。在天然培養(yǎng)基中的生長普遍比非天然培養(yǎng)基好。菌絲球的直徑在麩皮和米糠中最大，菌絲球的個(gè)數(shù)在干酪素中最多。

2.3 無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長的影響

表1 不同碳源對(duì)菌絲體生長的影響Table 1 Effect of carbon sources on mycelial growth

表2 不同氮源對(duì)菌絲體生長情況的影響Table 2 Effect of nitrogen sources on mycelial growth

表3 不同無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長的影響Table 3 Effect of mineral elements on mycelial growth

由表3可知，對(duì)菌絲體產(chǎn)量進(jìn)行方差分析得到，F(xiàn)=94.00，P＜0.01，差異極顯著，表明菌株在不同無機(jī)鹽條件下培養(yǎng)，菌絲體產(chǎn)量有顯著變化。Fe2+和Zn2+對(duì)柏樹火焰層孔菌的生長具有抑制作用。P、K、Mg元素對(duì)菌絲體生長均有較好的促進(jìn)作用。

2.4 C/N比對(duì)菌絲體生長的影響

表4 不同碳氮比對(duì)菌絲體生長的影響Table 4 Effect of C/N ratio on mycelial growth

由表4可知，對(duì)菌絲體產(chǎn)量進(jìn)行方差分析得F=8.5710，P＜0.01，表明不同的碳氮比對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響極顯著。為提高菌絲體產(chǎn)量，節(jié)約成本，C/N應(yīng)控制在20:1～25:1之間。

2.5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體生長的影響

表5 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體生長的影響Table 5 Effect of rotational speed on mycelial growth

由表5可知，轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，菌絲體的產(chǎn)量最高為0.17g，對(duì)菌絲體產(chǎn)量進(jìn)行方差分析得F=19.27，P＜0.05， 表明在不同轉(zhuǎn)速條件下菌絲體產(chǎn)量差異顯著。對(duì)菌絲球直徑和密度進(jìn)行方差分析，F(xiàn)直徑=12.96，P＜0.01，表明在不同轉(zhuǎn)速條件下菌絲球直徑有極顯著差異；F密度=31.57，P＜0.01，表明在不同轉(zhuǎn)速條件下菌絲球數(shù)量有極顯著差異。

2.6 溫度對(duì)菌絲體生長的影響

表6 不同溫度對(duì)菌絲體生長的影響Table 6 Effect of temperature on mycelial growth

由表6可知，菌絲體產(chǎn)量在25℃時(shí)最大，菌絲球直徑在30℃最大，菌絲球密度在25℃最大。對(duì)菌絲體產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，F(xiàn)=9.218，P=0.09，表明差異不顯著。對(duì)菌絲球直徑和密度進(jìn)行方差分析，F(xiàn)直徑=5.214，P＜0.05，差異顯著，表明在不同轉(zhuǎn)速條件下菌絲球直徑有顯著差異；F密度=15.457，P＜0.01，差異極顯著，

表明在不同轉(zhuǎn)速條件下菌絲球數(shù)量有極顯著差異。2.7pH值對(duì)菌絲體生長的影響

表7 不同pH值對(duì)菌絲體生長的影響Table 7 Effects of initial medium pH value on mycelial growth

由表7可知，pH值在5～7時(shí)菌絲體產(chǎn)量最大，說明柏樹火焰層孔菌的生長條件是適合中性偏酸性。對(duì)菌絲體產(chǎn)量進(jìn)行方差分析得F＝33.026，P＜0.01，差異極顯著。對(duì)菌絲球直徑和密度進(jìn)行方差分析，F(xiàn)直徑= 34.34，P＜0.01，差異極顯著，表明在不同pH值條件下菌絲球直徑有極顯著差異；F密度=98.14，P＜0.01，差異極顯著，表明在不同pH值條件下菌絲球數(shù)量有極顯著差異。

2.8 培養(yǎng)液裝瓶體積對(duì)菌絲體生長的影響

表8 不同裝瓶體積對(duì)菌絲體生長的影響Table 8 Effects of bottled volumes on mycelial growth

由表8可知，菌絲體產(chǎn)量在培養(yǎng)液為140mL/瓶中最大，培養(yǎng)液為100mL/瓶時(shí)發(fā)酵液單位體積菌絲體產(chǎn)量最高，表明最佳裝瓶體積應(yīng)該是100mL。菌絲球直徑最大的是160mL/瓶的，菌絲球個(gè)數(shù)最多的是60mL/瓶的。產(chǎn)生此原因可能是因?yàn)槠恐信囵B(yǎng)液體積小使菌絲球相互碰撞的次數(shù)多，使菌絲更加的分散，它的個(gè)數(shù)也相應(yīng)的較多。

單瓶產(chǎn)量(y)對(duì)裝瓶體積(x)的二元回歸方程：y=-0.000017x2+0.00454x-0.148，R2=0.975，P＜0.01，二元線性回歸極顯著。由二元回歸方程可知，當(dāng)裝瓶體積為133mL時(shí)，單瓶最高產(chǎn)量ymax=0.15g。

單位體積產(chǎn)量y對(duì)裝瓶體積(x)的二元回歸方程：y=-0.000013x2+0.002621x-0.000857，R2=0.968，P＜0.01，二元線性回歸極顯著。由二元回歸方程可知，當(dāng)裝瓶體積為101mL時(shí)，單位體積最高產(chǎn)量ymax=0.13g。

對(duì)菌絲球直徑和個(gè)數(shù)進(jìn)行方差分析得：F直徑=6.27，P＜0.01，差異極顯著，表明在不同裝瓶體積條件下菌絲球直徑有極顯著差異；F密度=78.64，P＜0.01，差異極顯著，表明在不同裝瓶體積條件下菌絲球數(shù)量有極顯著差異。

2.9 接種量對(duì)菌絲體生長的影響

表9 不同接種量對(duì)菌絲體生長的影響Table 9 Effects of inoculum amont on mycelial growth

由表9可知，在接種量為1、2mL時(shí)菌絲體產(chǎn)量相同，菌絲球直徑大小相差不大；菌絲球個(gè)數(shù)在接種量為10mL時(shí)最大。方差分析表明，F(xiàn)直徑=2.56，P＜0.05，差異顯著，表明在不同接種量條件下菌絲球直徑有顯著差異。F密度=277.54，P＜0.01，差異極顯著，表明在不同接種量條件下菌絲球數(shù)量有極顯著差異。

2.10 多因素試驗(yàn)結(jié)果

表10 多因素均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 10 Factors and levels in multifactor uniform design

如表10所示，多因素試驗(yàn)中菌絲體最低產(chǎn)量為0.05g，最高產(chǎn)量為0.21g，方差分析表明各個(gè)處理組的結(jié)果差異顯著，4個(gè)因素對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響方程為：y= -4.031-0.321x1-0.069x2-17.532x3+1.205x4。由方程可知，K2HPO4和pH值對(duì)結(jié)果的影響較大，葡萄糖和麩皮對(duì)結(jié)果的影響較小。配方6的菌絲體產(chǎn)量最高，表明葡萄糖含量為25g/L、麩皮 125g/L、K2HPO40.25g/L、pH6.5時(shí)，柏樹火焰層孔菌的菌絲體產(chǎn)量最高。

2.11 生長曲線實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，菌絲體生長動(dòng)態(tài)關(guān)系符合Logistic方程，生長曲線方程為：y=0.22/(1+1.019e-0.013x)。柏樹火焰層孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)大致經(jīng)歷4個(gè)階段。前4d菌絲生長速率緩慢，基本處于代謝調(diào)控狀態(tài)；第4～10天，菌絲生長速率大大增加，處于對(duì)數(shù)生長期；第11～14天，菌絲的合成代謝和分解代謝基本相等，菌絲體產(chǎn)量處于穩(wěn)定期；第15天后，菌絲體產(chǎn)量開始減少，進(jìn)

入衰老期。因此，在第11～14天停止發(fā)酵最經(jīng)濟(jì)。

圖1 柏樹火焰層孔菌菌絲體生長曲線Fig.1 Growth curve ofP. demidoffiimycelia

3 結(jié) 論

柏樹火焰層孔菌菌絲體可以通過液體發(fā)酵方式獲得，其發(fā)酵的最佳條件為：轉(zhuǎn)速150r/min、溫度25～30℃、最佳pH值在5～7。在相同條件下，單瓶產(chǎn)量是培養(yǎng)液裝瓶體積為140mL時(shí)最高，單位體積的產(chǎn)量是培養(yǎng)液裝瓶體積為100mL時(shí)最高，接種量8mL/100mL最為適宜。淀粉是長勢最好的碳源，麩皮是最廉價(jià)高產(chǎn)的氮源， P、K、Mg對(duì)菌絲體的生長均有較好的促進(jìn)作用，F(xiàn)e、Zn對(duì)菌絲體生長具有顯著抑制作用。液體培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)條件為：葡萄糖 25g/L、麩皮 125g/L、K2HPO40.25g/L、pH6.5。柏樹火焰層孔菌的生長曲線方程為：y=0.22/(1+1.019e-0.013x) ，發(fā)酵終點(diǎn)是11～14d，菌絲體產(chǎn)量為0.22g/100mL。

[1]KIRK P M, CANNON P F, MINTER D W, et al. Ainsworth & Bisby’s dictionary of the fungi[M]. 10th ed. London: CABI Bioscience, CAB International, 2008.

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[3]BEGA R V. Diseases of pacific coast conifers technical coordinator[M]. US, Washington: Forest Service US. Dept. of Agriculture, 1978.

[4]ZAKAULLAH. Decay in the Ziarat juniper forests of Baluchistan[J]. Pakistan Journal of Forestry, 1978, 28: 28-34.

[5]DAI Y C , HE X S. Pyrofomes demidoffii newly reported to cause a white trunk rot of juniper (Juniperus formosana) in China[J]. Plant Pathology, 2009, 58(4): 796.

[6]賀新生, 王茂, 李艷秋, 等. 樹舌靈芝菌絲體發(fā)酵工藝條件試驗(yàn)[J].食品科學(xué), 2008, 29(3): 288-292.

Optimization of Culture Conditions for the Mycelial Growth of Pyrofomes demidoffii

SU Jue，HE Xin-sheng*，ZHU Wen-kun
(School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

Pyrofomes demidoffii is a newly recorded species of a newly recorded genus in China, and it is also a rare medicinal mushroom. To find a both high yield and economical medium for the mycelial growth of Pyrofomes demidoffii, several culture conditions including carbon source, nitrogen source, C/N ratio, rational speed, culture temperature, initial medium pH value, the volume of medium in the fermentation vessel and inoculum amount were investigated through single factor experiments and the effects of three medium components and pH on the mycelial growth of Pyrofomes demidoffii were analyzed by multifactor uniform design. The above investigations were performed using a liquid medium. The optimum carbon source, nitrogen source and C/N ratio for the mycelial growth of Pyrofomes demidoffii were starch, wheat bran and 20:1-25:1. The mycelial growth of Pyrofomes demidoffii was promoted by P, K and Mg. A pH range between 5 and 7, the volume of medium in the fermentation vessel of 100 mL and inoculum amount of 8 mL/100mL were found optimum. The optimum composition of the liquid medium used consisted of glucose 25 g/L, bran 125 g/L and K2HPO4 0.25 g/L, pH 6.5. The mycelial growth of Pyrofomes demidoffii could be described by the logistic equation: y = 0.22/(1+1.019e-0.013x).

Pyrofomes demidoffii；liquid-state fermentation；mycelial yield

TQ920.6；S567.31

A

1002-6630(2010)23-0146-05

2010-01-20

四川省科技廳平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(08zh0009)；西南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(09ycjj02)

蘇玨(1985—)，女，碩士，主要從事天然藥物化學(xué)(菌物學(xué))研究。E-mail：sujue6@163.com

*通信作者：賀新生(1965—)，男，教授，本科，主要從事食用、藥用蕈菌資源研究。E-mail：hexinsheng@swust.edu.cn