周殿明,蔣健暉

（化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410082)

0 引言

RNA是除了DNA外的基因分子生物學(xué)的又一龐大家族，miRNA就是這個家族中的一個非常重要的成員。1993年，Lee等在線蟲（C.elegans）發(fā)現(xiàn)了第一個定時調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4[1]，也就是第一個miRNA；同時發(fā)現(xiàn)它不編碼任何蛋白質(zhì)，但是可以抑制Lin-14蛋白表達(dá),然而當(dāng)時的這個發(fā)現(xiàn)并未引起太多的關(guān)注。直到2000年，Reinhart等又在線蟲C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個miRNA-let-7[2]，miRNA這一非編碼基因家族的重要成員才開始在人們的眼前逐漸清晰起來。

miRNA是一類約22個堿基左右的非編碼蛋白的RNA，通常在18～25個堿基之間，成熟的miRNA 5'端有一個磷酸基團(tuán)，3'端是羥基。它主要通過信使RNA的直接剪切，或者間接抑制翻譯來實現(xiàn)基因調(diào)控作用。miRNA廣泛存在于各種真核生物中，它在生物體的產(chǎn)生過程如圖1所示。

首先攜帶miRNA信息的基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成較長的RNA,也就是通常所說的pri-miRNA，然后pri-miRNA會被一種叫做Drosha的RNA內(nèi)切酶Ⅲ剪切成60～70個堿基的含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA,即pre-miRNA。隨后，premiRNA被載體蛋白Exportin-5從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。到了細(xì)胞質(zhì)以后，pre-miRNA會從載體蛋白中脫落下來，被一種叫做Dicer的RNA內(nèi)切酶Ⅲ最終剪切成成熟的miRNA。此時的miRNA是雙鏈的結(jié)構(gòu)，其中5'端熱穩(wěn)定性較差的一條鏈將被特異性地整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，再與完全匹配的目標(biāo)信使RNA結(jié)合，或者通過誘導(dǎo)miRNA的降解，或者通過間接調(diào)節(jié)翻譯，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控功能。

圖1 miRNA在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生過程及調(diào)控原理圖Fig.1 Schematic of miRNA production and regulation in cell

從上面可以看出，miRNA由于其特殊的調(diào)控功能，不僅對生物的生長、發(fā)育和凋亡有著重要的影響，而且還與各種疾病比如神經(jīng)疾病、血管疾病、腫瘤和免疫方面[3～5]的疾病有著密切的關(guān)系。因此miRNA的檢測，對于醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)都有著非常重要的意義。近年來已有大量的文章涉及了這方面的工作，該文就是基于此對于目前世界上各個研究小組關(guān)于miRNA檢測方法的研究進(jìn)展做了一個簡要的綜述。

1 基于表面雜交的檢測技術(shù)

1.1 印跡雜交技術(shù)

印跡雜交技術(shù)（即nothern blotting）是最常用也是最早用于miRNA檢測的方法[6～9]，主要原理是將標(biāo)記的與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的DNA探針雜交到硝酸纖維素膜上，然后顯影檢測。該方法雖然已成為miRNA檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是仍然存在很多問題，比如靈敏度低，費(fèi)時等。Zolta′n Havelda小組于2004年將通過引入鎖核酸（LNA）對該方法進(jìn)行了改進(jìn)[10]，由于雜交效率得到改善，所以靈敏度提高了大約10倍。雖然如此，高靈敏度，高通量，特異性好的檢測技術(shù)仍然是個挑戰(zhàn)。

1.2 陣列平臺檢測技術(shù)

miRNA的陣列檢測技術(shù)主要是構(gòu)建含有與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的DNA的陣列，然后與目標(biāo)雜交，再通過各種各樣的信號檢測方法實現(xiàn)檢測目的。最常用的是通過聚合酶延伸的方法產(chǎn)生信號。2004年，Nelson等發(fā)展了一種名為基于陣列RNA引物介導(dǎo)的Klenow酶反應(yīng)（RAKE）的檢測技術(shù)[11](圖2)，該技術(shù)將DNA探針的5'端固定于玻璃表面，探針的3'端是與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的序列，緊挨著互補(bǔ)序列的是三個胸腺嘧啶核苷酸殘基，因此當(dāng)目標(biāo)存在時，將被探針捕獲到基底表面，單鏈的探針可以通過外切酶I切除，此時加入生物素化的dATP和Klenow聚合酶可以延伸出生物素化的腺嘌呤堿基，再與染料標(biāo)記的親和素結(jié)合產(chǎn)生熒光信號。另外,依賴于Poly(A)聚合酶的延伸方法也被引入到miRNA的檢測，Shingara等[12](圖3)利用Poly(A)聚合酶以RNA為引物延伸出氨基修飾的尿嘧啶核苷酸，再利用染料與氨基修飾的尿嘧啶核苷酸交聯(lián)，獲得熒光檢測信號。2006年，F(xiàn)ang等[13]同樣用Poly(A)聚合酶的延伸方法實現(xiàn)miRNA的檢測，不同的是延伸出的Poly(A)通過與Poly(T)修飾的納米金粒子結(jié)合做為信號獲得方式。

Liang等[14](圖4)采用了對miRNA直接修飾的方法實現(xiàn)對其檢測，將miRNA的3'端直接生物素修飾，然后再與親和素化的量子點結(jié)合，從而得到熒光信號。該陣列的檢測限可以達(dá)到0.4 fmol,檢測的動力學(xué)范圍為兩個數(shù)量級。

圖2 基于陣列RNA引物介導(dǎo)的Klenow酶反應(yīng)（RAKE）的檢測技術(shù)原理圖（RNA-primed,array-based Klenow enzyme(RAKE)assay）Fig.2 Schematic of RNA-primed,array-based Klenow enzyme assay(RAKE)

圖3 基于Poly(A)聚合酶延伸修飾堿基U的miRNA陣列檢測Fig.3 Schematic of miRNA microarray detection based on extension modified nucleotides U by Poly(A)

圖4 生物素化的miRNA通過量子點進(jìn)行陣列檢測原理圖Fig.4 Schematic of biotin modified miRNA profiling microarray detected with QD

DNA/RNA雜交體的特異性抗體被以一種新的標(biāo)記方式引入到miRNA的檢測中來，Hu等[15]構(gòu)建了一個傳感陣列，直接將未標(biāo)記的目標(biāo)miRNA與固定的DNA探針雜交，然后加入不依賴于序列信息的抗DNA/RNA雜交體的單克隆抗體，該抗體與染料標(biāo)記的二抗結(jié)合，或者與生物素標(biāo)記二抗和染料標(biāo)記的親和素反應(yīng)，都可以得到檢測信號。

除了上述的陣列檢測平臺以外，還有很多這方面的報道，比如利用生物發(fā)光酶標(biāo)記的miRNA與待測miRNA競爭雜交到固定化的DNA探針上[16]，通過檢測生物發(fā)光強(qiáng)度實現(xiàn)目標(biāo)檢測的方法等等[17～20]。

1.3 電化學(xué)檢測技術(shù)

硅納米線[21]（SiNWs）以其優(yōu)越的性能被廣泛應(yīng)用于化學(xué)生物傳感器，將肽核酸固定在其表面上可以作為檢測miRNA的探針，當(dāng)與檢測對象miRNA進(jìn)行雜交時，將會引起SiNWs界面電阻的變化，其變化值與miRNA濃度相關(guān).該技術(shù)無需標(biāo)記，檢測miRNA濃度的下限可達(dá)1 fmol/L，具有良好的特異性。Lusi等[22](圖5)發(fā)展了另一種無標(biāo)記電化學(xué)檢測技術(shù)，將用次黃嘌呤修飾的不含鳥嘌呤的DNA做為固定探針，目標(biāo)miRNA存在時可以直接檢測目標(biāo)中鳥嘌呤的電化學(xué)信號，實現(xiàn)miRNA的檢測。此外，F(xiàn)an等[23]利用目標(biāo)介導(dǎo)在納米間隙電極上沉積導(dǎo)電聚合物納米線的方法進(jìn)行miRNA的檢測。該方法首先將肽核酸固定于電極間隙中，與完全互補(bǔ)的目標(biāo)鏈雜交以后，由于肽核酸不含電荷，而目標(biāo)呈負(fù)電性，可以通過靜電作用結(jié)合帶有正電的苯胺，在酶催化的條件下，形成導(dǎo)電的聚苯胺納米線，電極的導(dǎo)電性與目標(biāo)物的含量成比例。該傳感裝置可以檢測低至5 fmol/L的miRNA。除了無標(biāo)記電化學(xué)的檢測技術(shù)外，還可以通過目標(biāo)miRNA直接修飾具有電化學(xué)催化活性的物質(zhì)，比如氧化鋨納米粒子[24]和Ru(PD)2Cl2[25]，這些電化學(xué)催化物質(zhì)都可以催化肼的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生電化學(xué)信號，從而達(dá)到檢測miRNA的目的。

圖5 電化學(xué)檢測次黃嘌呤修飾的捕獲探針與目標(biāo)miRNA雜交Fig.5 Electrochemical detection of the hybridization between the Inosine-modified capture probe and target miRNA

2 均相miRNA檢測技術(shù)

2.1 基于PCR信號放大的檢測技術(shù)

圖6 基于莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的實時定量PCR技術(shù)（stem-loop RT-PCR）Fig.6 Real-time PCR based on stem-loop RT primer

PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)。美國科學(xué)家Mulis因發(fā)明了該技術(shù)獲得了1995年諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物（primer）的DNA分子，大約20個堿基左右，在一種耐熱的DNA聚合酶的作用，可以在較短的時間內(nèi)把極少的DNA量提高千萬倍之多。PCR技術(shù)對分子生物學(xué)研究起到了巨大的推動作用，而且隨著PCR技術(shù)的日趨完善，PCR在人類社會生活中的應(yīng)用也越來越廣泛。2005年，Chen等[26](圖6)將反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)引入到miRNA的檢測當(dāng)中，建立了名為莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)（stem-loop RT-PCR）。他首先設(shè)計了一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄的探針，據(jù)報道這種結(jié)構(gòu)大大提高了反轉(zhuǎn)錄的效率和特異性。當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時，該探針與其雜交進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再加入正反引物和Taqman探針，進(jìn)行定量PCR。該方法可以檢測總RNA中低至25 pg的miRNA，實際上，高的靈敏度和特異性可以使該方法用于單個細(xì)胞的miRNA檢測而不需要核酸純化。該方法有很強(qiáng)的實用性，可以用于各種miRNA檢測[27]。與此類似的，Raymond等[28]用一個普通的基因特異性線性探針進(jìn)行雜交反轉(zhuǎn)錄，然后利用一個短的序列與被測物相關(guān)含有鎖核酸的引物，和另一個通用的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在一定程度上也可以提高特異性。與上面兩種反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)不同，Soroush及其研究團(tuán)隊[29]首先用一個含有六個堿基和目標(biāo)互補(bǔ)的探針與miRNA雜交，該探針同時含有5'端多余的堿基，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，產(chǎn)生含有5'端突出cDNA，此時加入同樣5'端突出的與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生部分序列互補(bǔ)的探針，該探針與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交相互為模板延伸，這樣就相當(dāng)于在miRNA的兩測引入了通用序列，可以用通用引物擴(kuò)增。該技術(shù)檢測的動力學(xué)范圍可達(dá)6～8個數(shù)量級，下限可達(dá)0.2 fmol/L。不過這些方法都是通過探針與目標(biāo)miRNA直接雜交進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的，由于miRNA序列短，所以需要用各種辦法來提高雜交效率，但是有一種檢測技術(shù)可以避免這個問題[30]，通過Poly(A)聚合酶延伸miRNA產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合序列Poly(A)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用同樣的兩個引物，一個是通用的，一個是miRNA特異的進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。2009年，Li等[31](圖7)建立一種不依賴反轉(zhuǎn)錄的PCR檢測技術(shù)，該技術(shù)設(shè)計了兩個探針，分別由兩部分組成，一部分可以與目標(biāo)miRNA完全互補(bǔ)，另一部分是引物結(jié)合序列。這樣，兩個探針在與miRNA互補(bǔ)配對后，由連接酶連接成一條完整的定量PCR模板，加入上下游引物，則可以進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。

圖7 基于酶連接實時PCR用于檢測miRNAFig.7 Real-time PCR assay for detection of miRNA based on enzymatic ligation

2.2 基于RCA的檢測技術(shù)

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling Circle Amplification）也叫滾環(huán)復(fù)制技術(shù)，是一種等溫擴(kuò)增方法，它以環(huán)狀DNA為模板，在引物存在時，聚合酶將連續(xù)復(fù)制出無數(shù)個環(huán)的互補(bǔ)序列拷貝。該技術(shù)已經(jīng)成為生物分析領(lǐng)域的核心技術(shù)，得到了廣泛的應(yīng)用。2006年，Jonstrup等[32]將RCA技術(shù)用于miRNA的檢測，miRNA首先做為模板將探針連成環(huán)，同時做為引物在聚合酶的作用下延伸聚合放大。Cheng等[33]在此基礎(chǔ)上發(fā)展了miRNA檢測的分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（branched rolling-circle amplification）。仍舊以miRNA為模板和引物，不同的是，引入了第二個引物，序列與環(huán)的一部分相同，可以與滾環(huán)產(chǎn)物雜交并延伸擴(kuò)增，再通過聚合酶的鏈置換活性不僅可以擴(kuò)增出環(huán)互補(bǔ)序列的無數(shù)個拷貝，還可以在引物2的作用下延伸出和環(huán)相同序列的無數(shù)個拷貝。最后通過染料嵌入實現(xiàn)信號檢測。與前兩種方法不同的是，Yao等[34]首先將引物與目標(biāo)雜交進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物將以另一個橋探針為模板，連成環(huán)狀分子。再加入引物1進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，加入引物2進(jìn)行分支擴(kuò)增。每次反應(yīng)體系可以檢測103～1010個拷貝的miRNA，動力學(xué)范圍很寬，而且可以區(qū)分單堿基錯配和區(qū)分成熟的miRNA及其前體(圖8)。

2.3 其它均相檢測技術(shù)

除了基于PCR和RCA為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)外，還有很多均相檢測技術(shù)，比如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[35]，陽離子聚合物[36]，invader反應(yīng)[37]，基于核酶的信號放大檢測技術(shù)[38]，同位素標(biāo)記連接技術(shù)[39]，和將反轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄結(jié)合的信號檢測技術(shù)等等[40]。

圖8 基于RCA的miRNA檢測技術(shù)（A[32],B[33],C[34]）Fig.8 miRNA detection based on RCA

3 結(jié)論

綜上所述，miRNA做為一種重要的基因表達(dá)調(diào)控手段，參與各種生物活動，和控制多種疾病的發(fā)生發(fā)展。其檢測手段也越來越受到人們的重視，各種各樣的檢測技術(shù)已被運(yùn)用到miRNA的檢測之中，但是無論是界面檢測技術(shù)還是均相檢測技術(shù)，存在自身優(yōu)點的同時都或多或少存在不足，獲得高靈敏度，高通量，高選擇性，高特異性的檢測技術(shù)仍然需要生物分析專業(yè)研究者的進(jìn)一步努力。

[1]Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lim-14[J].Cell,1993,75:843～854.

[2]Reinhart B J,Slack F J,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegants[J].Nature,2000,403(6772):901～906.

[3]Lukiw W J,Zhao Y,Cui J G.An NF-kappaB-sensitive micro RNA-146a-mediated inflammatory circuit in Alzheimer disease and in stressed human brain cells[J].J Biol Chem,2008,283(46):31 315～31 322.

[4]Thum T,Gross C,Fiedler J,et al.MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts[J].Nature,2008,456(7 224):980～984.

[5]Xiao C,Rajewsky K.MicroRNA control in the immune system:basic principles[J].Cell,2009,136(1):26～36.

[6]Reinhart B J,Slack F J,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6 772):901～906.

[7]Lee R C,Ambros V.An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans[J].Science,2001,294(5 543):862～864.

[8]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science,2001,294(5 543):853～858.

[9]Calin G A,Dumitru C D,Shimizu M,et al.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(24):15 524～15 529.

[10]Válóczi A,Hornyik C,Varga N,et al.Sensitiveand specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes[J].Nucleic Acids Res，2004,32(22):e175.

[11]Nelson P T,Baldwin D A,Scearce L M,et al.Microarraybased,high-throughput Gene expression profiling of microRNAs[J].Nat.Methods,2004,1:155～161.

[12]Shingara J,Keiger K,Shelton J,et al.An optimized isolation and labeling platform for accurate microRNA expression profiling[J].RNA，2005,11(9):1 461～1 470.

[13]Fang S,Lee H J,Wark A W,et al.Attomole microarray detection of microRNAs by nanoparticle-amplified SPR imaging measurements of surface polyadenylation reactions[J].J Am Chem Soc，2006，128(43):14 044～14 046.

[14]Liang R Q,Li W,Li Y,et al.An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe[J].Nucleic Acids Res，2005,33(2):e17.

[15]Hu Z,Zhang A,Storz G,et al.An antibody-based microarray assay for small RNA detection[J].Nucleic Acids Res，2006，34(7):e52.

[16]Cissell K A,Rahimi Y,Shrestha S,et al.Bioluminescence-based detection of MicroRNA,miR21 in breast cancer cells[J].Analytical Chemistry，2008,80:2 319～2 325.

[17]Baskerville S,Bartel D P.Microarrayprofilingof microRNAs reveals frequent coexpression with neighboring miRNAs and host genes[J].RNA，2005,11(3):241～247.

[18]Wang H,Ach R A,Curry B.Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA[J].RNA,2007,13(1):151～159.

[19]Chen J,Lozach J,Garcia E W,et al.Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology[J].Nucleic Acids Res,2008,36(14):e87.

[20]Li J,Schachermeyer S,Wang Y,et al.Detection of microRNA by fluorescence amplification based on cationexchange in nanocrystals[J].Anal Chem.,2009,81(23):9 723～9 729.

[21]Zhang G J,Chua J H,Chee R E,et al.Label-free direct detection of MiRNAs with silicon nanowire biosensors[J].Biosens Bioelectron,2009，24(8):2 504～2 508.

[22]Lusi E A,Passamano M,Guarascio P,et al.Innovative electrochemical approach for an early detection of microRNAs[J].Anal Chem,2009，81(7):2 819～2 822.

[23]Fan Y,Chen X,Trigg A D,et al.Detection of MicroRNAs using target-guided formation of conducting polymer nanowires in nanogaps[J].J Am Chem Soc,2007，129(17):5 437～5 443.

[24]Gao Z,Yang Z.Detection of microRNAs using electrocatalytic nanoparticle tags[J].Anal Chem,2006，78(5):1 470～1 477.

[25]Gao Z,Yu Y H.Direct labeling microRNA with an electrocatalytic moiety and its application in ultrasensitive microRNA assays[J].Biosens Bioelectron,2007，22(6):933～940.

[26]Chen C,Ridzon D A,Broomer A J,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005,33(20):e179.

[27]Tang F,Hajkova P,Barton S C,et al.MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells[J].Nucleic Acids Res,2006,34(2):e9.

[28]Raymond C K,Roberts B S,Garrett-Engele P,et al.Simple,quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs[J].RNA,2005,11(11):1 737～1 744.

[29]Sharbati-Tehrani S,Kutz-Lohroff B,Bergbauer R,et al.miR-Q:a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample[J].BMC Mol Biol,2008,9:34.

[30]Shi R,Chiang V L.Facilemeansforquantifying microRNA expression by real-time PCR[J].Biotechniques.2005,39(4):519～525.

[31]Li J,Yao B,Huang H,et al.Real-time polymerase chain reactionmicroRNAdetectionbased on enzymatic stem-loop probes ligation[J].Anal Chem,2009,81(13):5 446～5 451.

[32]Jonstrup S P,Koch J,Kjems J.A microRNA detection system based on padlock probes and rolling circle amplification[J].RNA,2006,12(9):1 747～1 752.

[33]Cheng Y,Zhang X,Li Z,et al.Highly sensitive determination of microRNA using target-primed and branched rolling-circle amplification[J].Angew ChemInt Ed Engl,2009,48(18):3 268～3 272.

[34]Yao B,Li J,Huang H,et al.Quantitative analysis of zeptomole microRNAs based on isothermal ramification amplification[J].RNA,2009,15(9):1 787～1 794.

[35]Yan J,Li Z,Liu C,et al.Simple and sensitive detection of microRNAs with ligase chain reaction[J].Chem Commun(Camb),2010,46(14):2 432～2 434.

[36]Zhang Y,Li Z,Cheng Y,et al.Colorimetric detection of microRNA and RNase H activity in homogeneous solution with cationic polythiophene derivative[J].Chem Commun(Camb),2009,(22):3 172～3 174.

[37]Allawi H T,Dahlberg J E,Olson S,et al.Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay[J].RNA,2004,10(7):1 153～1 161.

[38]Hartig J S,Grüne I,Najafi-Shoushtari S H,et al.Sequence-specific detection of MicroRNAs by signal-amplifying ribozymes[J].J Am Chem Soc,2004,126(3):722～723.

[39]Maroney P A,Chamnongpol S,Souret F,et al.A rapid,quantitative assay for direct detection of microRNAs and other small RNAs using splinted ligation[J].RNA,2007,13(6):930～936.

[40]Siva A C,Nelson L J,Fleischer C L,et al.Molecular assays for the detection of microRNAs in prostate cancer[J].Mol Cancer,2009,8:17.