張智慧，應(yīng)淑華，史汶靈，范小雪，黃杉生

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

隨著農(nóng)藥的大量使用或濫用,導(dǎo)致農(nóng)藥在食品和環(huán)境中殘留量的嚴重超標(biāo)，因此農(nóng)藥所帶來的生態(tài)與環(huán)境問題日益嚴重。由農(nóng)藥中毒引起的事件和在對外農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中引發(fā)的爭端時有發(fā)生。因此對農(nóng)藥殘留量的檢測引起了人們越來越多的關(guān)注，發(fā)展一種靈敏、快速、實用、可靠的農(nóng)殘檢測方法尤為緊迫[1]。近年來，在許多國家及地區(qū)的地下水、地表水以及大氣沉降物中都檢測出了阿特拉津的殘留物,其對生態(tài)環(huán)境的影響具有全球性，在土壤中的保留期長且對糧食和食品安全造成潛在威脅,并影響人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)[2]，因此深入研究阿特拉津的生態(tài)風(fēng)險問題是當(dāng)務(wù)之急。

阿特拉津（簡寫為atr,下同），又叫莠去津,化學(xué)名為2-氯-4-乙氨基-6-異丙氨基-1,3,5-三嗪,系均三氮苯類農(nóng)藥，是一種人工合成的化學(xué)除草劑?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。目前，阿特拉津檢測方法有色譜法、電流分析法和ELISA法等[3～8],但這些方法不適宜現(xiàn)場快速實時檢測。近年來，簡單快速的使用免疫快速檢測、生物和電化學(xué)生物傳感器等技術(shù)來檢測農(nóng)殘含量已經(jīng)取得較快發(fā)展。

圖1 阿特拉津的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of ATR

該論文通過層層自組裝的方法在電極上固定酪氨酸酶，利用阿特拉津?qū)野彼崦傅囊种谱饔脕韺崿F(xiàn)對阿特拉津殘留量的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

酪氨酸酶(由蘑菇中取得，5 370 U/mg）購于Sigma公司;L-半胱胺酸(L-Cys,97%)購自Sigma公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)由0.1mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L NaH2PO4配制，并用0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值。其余試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

透射電子顯微鏡（TEM,JEM-2010,日本）；循環(huán)伏安（CV）和電化學(xué)阻抗譜圖（EIS）的測量在CHI 660B電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司，中國)上進行，采用三電極體系：修飾電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極(SCE)；測試底液為5 mL 0.1 mol/L PBS(0.5 mol/L NaCl,pH7.0)。所有的實驗條件均在室溫下進行。

1.2 傳感器的制備

1.2.1 納米銀的制備

參照文獻[9]的方法,在劇烈攪拌的條件下，將一定體積1.0×10-3mol／L的AgNO3，溶液按體積比1∶3逐滴加入到2.0×10-3mol／L的NaBH4溶液中，制得的銀溶膠呈亮黃色，通過透射電鏡觀察（圖2），納米銀的平均粒徑為15 nm。納米銀的紫外可見光譜表明，在470 nm處出現(xiàn)了吸收峰，是納米銀的特征吸收峰。

圖2 納米銀的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of Ag nanoparticles

1.2.2 電極的制備

金電極分別用1.0、0.3、0.05 mm的氧化鋁粉末拋光，直至產(chǎn)生一個光亮、平滑的表面。電極分別置于硝酸、無水乙醇、超純水里超聲清洗3 min后，在0.5 mol/L H2SO4中于-0.35～1.70 V的電位范圍內(nèi)，以100 mV/s的速度循環(huán)掃描至電流穩(wěn)定為止。電極用超純水徹底清洗后，并用氮氣將其表面吹干。將處理好的電極浸泡于0.1 mol/L除氧的L-半胱胺水溶液中，置黑暗處7 h,得到L-半胱胺修飾電極。用超純水徹底清洗以除去L-半胱胺的物理吸附之后,將電極浸泡于自制的銀溶膠12 h得到納米銀/L-半胱胺修飾的金電極。用PBS(pH7.0)洗滌修飾電極，并將電極浸于5 mg/mL的酪氨酸酶(pH7.0 PBS)溶液中，置于冰箱過夜后取出，最后電極在25%的戊二醛溶液中浸泡半個小時，取出后徹底用PBS洗滌干凈。電極不用時保存在4℃下0.1 mol/L PBS(pH7.0)中。電極表面的修飾過程見圖3。

圖3 電極的組裝過程Fig.3 The assembly process of the electrode

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極在PBS中的電化學(xué)行為

圖4為不同修飾電極進行循環(huán)伏安曲線。在-0.25～0.68 V的電位范圍內(nèi)，在0.1 mol/L PBS(pH7.0)中，裸的Au(曲線a)、L-cys/Au(曲線b)均沒有明顯的氧化還原峰；然而對于納米銀粒子修飾的電極nano-Ag/L-cys/Au(曲線c),則出現(xiàn)了一對比較對稱的氧化還原峰，但峰電流較?。划?dāng)電極上修飾上酪氨酸酶后，tyrosinase/nano-Ag/L-cys/Au(曲線d)，則出現(xiàn)了一對峰形對稱的氧化還原峰（Epa=0.285 V,Epc=0.054 V），這是由于固定在電極表面的酪氨酸酶的電活性中心發(fā)生電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生,與文獻報道的結(jié)果相近[10]。

圖4 修飾電極在0.1 mol/L PBS(pH7.0)中的循環(huán)伏安圖(a)裸Au；(b)L-cys/Au；(c)nano-Ag/L-cys/Au；(d)tyrosinase/nano-Ag/L-cys/Au;掃描速度：100 mV/sFig.4 The cyclic voltammograms of every layer modified electrodes in 0.1 mol/L PBS(pH7.0)Scan rate:100 mV/s

2.2 電極層層自組裝過程的電化學(xué)阻抗譜圖

電化學(xué)阻抗譜圖（EIS）可用來表征電極表面每一步修飾過程中的變化,圖5顯示了層層修飾的電化學(xué)阻抗圖譜的Nyquist曲線。從圖5可以看出，裸金電極的阻抗圖（bare Au,曲線a)是一個直徑較大的半圓，阻抗值約為500 Ω。在金電極上修飾上L-半胱胺酸后（L-cys/Au,曲線b),其阻抗急劇下降。當(dāng)電極上修飾納米銀之后（nano-Ag/L-cys/Au曲線c）阻抗值繼續(xù)減小,這是由于納米銀促進Fe(CN)63-/4-間的轉(zhuǎn)移。當(dāng)酪氨酸酶修飾到電極表面上，可以看到阻抗明顯增大（tyrosinase/nano-Ag/L-cys/Au，曲線d），這是因為電極表面吸附上的酶阻礙了Fe(CN)3-/Fe(CN)64-在電極表面的電子傳遞。修飾電極制備過程中阻抗的變化表明了酪氨酸酶已經(jīng)被修飾在電極的表面上。

圖5 不同修飾層電極的阻抗譜圖(a)裸Au;(b)L-cys/Au;(c)nano-Ag/L-cys/Au;(d)tyrosinase/nano-Ag/L-cys/AuFig.5 The EIS images of different layers modified electrodes

2.3 生物傳感器響應(yīng)性能的測定

圖6顯示酶修飾電極在0.1 mol/L PBS(pH7.0)溶液中與依次加入一定量的阿特拉津的循環(huán)伏安圖。由圖6可見,隨著加入的阿特拉津量的增加,峰電流變小。這是由于阿特拉津?qū)野彼崦傅幕钚杂幸种谱饔?。?dāng)阿特拉津濃度在8.7×10-7～8.2×10-5mol/L范圍內(nèi)與其峰電流成良好的線性關(guān)系（圖6插圖），其線性回歸方程為Ip=-0.328 c(atrazine)+4.414，相關(guān)系數(shù)為-0.993 4，其檢出限為5.4×10-7mol/L（3倍信噪比）。

2.4 實驗最佳條件的選擇

2.4.1 pH的選擇

考察了pH值對傳感器響應(yīng)電流的影響（圖7）。當(dāng)?shù)滓褐械膒H小于7時,響應(yīng)電流隨著pH的增大而增大；當(dāng)pH=7時響應(yīng)電流達到最大值，此時酪氨酸酶的活性最好；與文獻報道的酪氨酸酶保持最佳活性的pH范圍基本一致[11]。當(dāng)pH大于7時，響應(yīng)電流隨著pH的增大反而減小，這是因為酶的活性逐漸下降。因此實驗選擇pH值為7.0的PBS作為支持電解質(zhì)。

2.4.2 溫度的選擇

溫度是影響酶活性的另一個重要因素，圖8考察了溫度對傳感器響應(yīng)電流的影響。當(dāng)溫度在20～30℃范圍內(nèi)酶的活性隨溫度的升高略有增加，但變化不大。當(dāng)超過30℃時響應(yīng)電流急劇下降,這是由于溫度過高時會導(dǎo)致酶部分失活。與文獻報道的酪氨酸酶保持最佳活性的溫度范圍基本一致[12]。因此實驗選擇30℃作為實驗溫度。

圖6 阿特拉津在tyrosinase/nano-Ag/L-cys/Au修飾電極的響應(yīng)(a)1×10-6mol/L；(b)2.9×10-5mol/L；底液:0.1 mol/L PBS(pH7.0);掃速：100 mV/s;插圖:阿特拉津的電流響應(yīng)校正曲線Fig.6 Response of atrazine at modified electrodes in 0.1mol/L PBS(pH7.0)Inset:Calibration of current response of atrazine at tyrosinase/nano-Ag/L-cys/Au

圖7 不同pH對傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.7 Effect of pH on the current response of modified electrodes

圖8 溫度對傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.8 Effect of temperature on the current response of modified electrodes

2.4.3 納米粒子對傳感器的影響

研究了納米粒子對傳感器的影響（圖9）。曲線a為加入納米銀粒子傳感器的連續(xù)電流響應(yīng)；曲線b為無納米銀粒子的情況下傳感器的連續(xù)電流響應(yīng)。結(jié)果顯示納米銀修飾的傳感器比較穩(wěn)定。這不僅是因為納米銀對酪氨酸酶有較強的吸附作用，可以防止酪氨酸酶的脫離；更重要的是納米粒子的引入，可以大幅度的提高電流響應(yīng)的靈敏度[13～16]。

2.4.4 電極的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及干擾實驗

在5 mL 0.1 mol/L PBS（pH=7.0）的溶液加1×10-6mol/L阿特拉津,連續(xù)測定7次，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.9%，說明該傳感器有較好的重現(xiàn)性。當(dāng)該傳感器不用時,置于4℃的PBS(pH=7.0)溶液中保存。一周后,該傳感器活性仍能達到其初始信號的91.5%。說明此電極具有良好的穩(wěn)定性。

圖9 納米粒子對傳感器響應(yīng)電流的影響(a)含納米銀顆粒;(b)不含納米銀顆粒（假定初始電流為100%）Fig.9 Current responses of modified electrodes containing Ag nanoparticles or not

為了考察該酪氨酸酶傳感器的抗干擾性，在1×10-6mol/L阿特拉津溶液中分別加入一定濃度的2，4-二氯苯酚、敵草隆、L-賴氨酸和尿酸進行測定，以干擾物質(zhì)造成的誤差在5%之內(nèi)作為干擾指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50倍的L-賴氨酸和尿酸對阿特拉津的測定不產(chǎn)生明顯干擾,當(dāng)2，4-二氯苯酚、敵草隆的濃度超過阿特拉津的25倍時，即產(chǎn)生干擾，可能是這些物質(zhì)在修飾電極上的電活性電位與阿特拉津相同，這表明酶傳感器的抗干擾性較好。

2.4.5 實際樣品的測定及回收率

取不同的濃度的未知樣品作為待測的實際樣品,以上述方法測定阿特拉津濃度，結(jié)果見表1。在上述的3份實際樣品中分別加入10.0 μmol/L阿特拉津標(biāo)準(zhǔn)溶液,進行回收率測定,結(jié)果也列入表1,該方法測定的回收率為95%～105%。說明該方法制備的酪氨酸酶傳感器為測定阿特拉津?qū)嶋H含量提供了一種較為精確的方法。

表1 樣品的檢測(n=3)Tab.1 The determination results of samples(n=3)

3 結(jié)論

基于tyrosinase/nano-Ag/L-cys/Au的新型酪氨酸酶傳感器，有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。它為濃度范圍介于8.7×10-7～8.2×10-5mol/L之間阿特拉津的檢測提供了一個簡單、廉價的方法，最低檢測限為5.4×10-7mol/L(3倍信噪比)。

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