林 荊，張金虎，鄭 宇，楊 勇，余 釵，吳文凡

(福清出入境檢驗檢疫局，福建 福清 350300)

水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定

林 荊，張金虎，鄭 宇，楊 勇，余 釵，吳文凡

(福清出入境檢驗檢疫局，福建 福清 350300)

建立同時測定水產(chǎn)品中6種四環(huán)素類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法。用0.01mol/L Na2EDTA-Mcllvaine磷酸鹽緩沖溶液提取，樣液過濾后正己烷除脂，經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，氮氣吹干緩沖液定容后，用反相液相色譜分離，電噴霧正離子模式離子化，用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)監(jiān)測，三重四級桿質(zhì)譜測定，外標(biāo)法定量。該法對四環(huán)素類藥物在5.0～50.0μg/kg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r在0.9969～0.9999之間，在5.0、10.0、25.0、50.0μg/kg添加水平，回收率為61%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～5.7%，其檢出限達2.5μg/kg，方法操作簡便，穩(wěn)定性好，選擇性好，靈敏度高。

水產(chǎn)品；四環(huán)素類抗生素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

四環(huán)素類藥物為并四苯衍生物，具有十二氫化并四苯基本結(jié)構(gòu)(圖1)，該類藥物有共同的A、B、C和D四個環(huán)的母核，通常在5、6、7位上有不同的取代基。其中尤以土霉素、四環(huán)素、金霉素的抗菌譜最廣，對革蘭氏陽性菌、陰性菌均具有較強的抗菌作用，在畜禽、水生生物等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)被廣泛用于動物疾病的預(yù)防和治療[1]。四環(huán)素類藥物可在動物體內(nèi)殘留，并隨魚類、乳制品、蛋等食品進入人體，危害人體健康，具體表現(xiàn)為對人的肺、胃腸、腎臟、皮膚和骨骼造成損害，尤其是對兒童的牙齒損害最大。近年來，日本、澳大利亞等對畜、禽肉中抗生素殘留問題進行了大量研究，日本厚生省要求進口畜禽肉中四環(huán)素族殘留量不得超過0.05mg/kg。澳大利亞規(guī)定四環(huán)素類總量不得大于0.3mg/kg。歐盟一律標(biāo)準(zhǔn)為0.01mg/kg。我國早在1991年就出臺國標(biāo)對蜂蜜中四環(huán)素類的最高殘留量進行規(guī)定：不得大于0.05mg/kg，也針對它們在畜禽肉及水產(chǎn)品中的最高允許殘留量進行規(guī)定[2]。

圖1 四環(huán)素類抗生素的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of tetracyclines

目前，測定動物源性食品中抗生素類藥物殘留的主要方法有高效液相色譜法[3-7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-10]、微生物法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]、薄層色譜法[13]和化學(xué)發(fā)光法[14]。本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化超高效液相色譜條件和質(zhì)譜條件，建立以磷酸鹽緩沖溶液提取，Oasis HLB固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測定水產(chǎn)品中6種四環(huán)素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰻魚、蝦 福建省福清市某養(yǎng)殖場。

甲醇、甲酸和乙酸銨(色譜純) 德國Merck公司；抗生素標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；定溶液和流動相用水為Minipore-Q超純水，其余皆為石英二次蒸餾水；其他試劑均為分析純 中國國藥化學(xué)試劑有限公司。

0.01 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：稱取12.90g檸檬酸、27.64g磷酸二氫鈉和3.72g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，用1.00L超純水溶解搖勻，用作提取液和定溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg于燒杯中，用少量色譜純甲醇溶解并分別定容至100mL容量瓶中，混勻，質(zhì)量濃度為100g/mL(該溶液在－18℃冰箱中可保存12個月)。需要時再將其配成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀(UPLC)、Premier四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源(ESI+)及Masslynx4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、ACQUITY UPLC BEH(2.1mm×100mm，1.7μm)色譜柱、固相萃取柱(Oasis HLB，60mg，3mL) 美國Waters公司；Millipore超純水儀 Gradient公司；Sigma 2-5高速離心機 德國Sigma公司；BP211D分析天平(感量0.0001g) 北京Sartorius公司；天平BH-600(感量0.01g) 上海英展機電企業(yè)有限公司；ELx800酶標(biāo)儀德國Bio-tek公司；DC-12氮吹儀 上海安普科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

提?。悍Q取2.00g均質(zhì)后的樣品，置于50mL離心管中，加入20mL 0.01mol/L Na2EDTA-Mcllvaine提取液，超聲提取30min，3000r/min離心5min，取出上清液，分兩次加入40mL正己烷除脂，按上述同樣條件離心，棄去正己烷，留水層過濾后待凈化。

凈化：固相柱預(yù)先用5mL甲醇、5mL水和3mL飽和Na2EDTA溶液活化；取10mL提取液過柱，待提取液完全流出后，用5mL水沖洗柱，棄去流出液。固相萃取柱在65kPa負(fù)壓下，減壓抽干30min，注入5mL甲醇，收集流出液于10mL離心管中，40℃以下氮吹至干，加入1mL定溶液溶解殘渣，過0.22μm濾膜后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動相：甲醇-0.5mmol/L乙酸銨溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸)，梯度洗脫程序見表1；流速0.3mL/min、柱溫35℃、進樣量10μL、總運行時間5min。

表1 流動相梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3.3 質(zhì)譜條件

表2 6種四環(huán)素類藥物的LC-ESI MS/MS儀器參數(shù)Table2 LC-ESI MS/MS parameters for analyzing six tetracylines

電噴霧離子源，正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測MRM；毛細管電壓1.0kV；離子源溫度120℃；去溶劑溫度350℃；霧化器流速600L/h；反吹氣流速50L/h；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

[3-1 0]對比體積分?jǐn)?shù)2%的高氯酸和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取劑，提取鰻魚和蝦樣品。結(jié)果表明：用高氯酸提取樣品，蛋白質(zhì)易沉淀，雜質(zhì)較少，但有些藥物的回收率偏低；Na2EDTAMcllvaine溶液提取的脂肪過多，在過柱時容易形成油狀層影響過柱速率，故在提取時將此提取液經(jīng)過與正己烷混合去油脂后再過柱，全部藥物的提取效果均較理想。

2.2 凈化條件的選擇

本研究比較C18小柱、Oasis HLB、Oasis MAX的萃取效率，結(jié)果表明：HLB固相萃取柱萃取效率最高，6次實驗的平均回收率都在70%以上；MAX固相萃取柱次之，平均回收率在50%左右；C18小柱的平均回收率大部分為30%～50%，而對四環(huán)素和土霉素的回收率只有10%～20%。故在實驗中選擇Oasis HLB固相萃取柱凈化。

比較不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙酸乙酯的洗脫液效果，結(jié)果顯示，1 0 0%甲醇即可達到洗脫完全的效果，且可以減少加入乙酸乙酯洗脫帶來的油脂干擾，可以獲得較高而相對穩(wěn)定的回收率，便于凈化后的濃縮。

2.3 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下的各四環(huán)素總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of six tetracylines obtained under multiple reaction monitoring (MRM) mode

在質(zhì)譜條件中，各化合物均選用[M+H]+作為母離子，故甲酸的加入有助于化合物的質(zhì)子化。實驗發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入乙酸銨可增加四環(huán)素類化合物在柱中的保留，其分離度加大且峰形得到有效改善。以100%甲醇、30%甲醇水、甲醇-10mmol/L三氟乙酸溶液(1:19，V/V)作為定溶液時，四環(huán)素類化合物的響應(yīng)值遠低于用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液作為定溶液，且出峰時間不穩(wěn)定，因此選用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液作為定溶液可以保證化合物有足夠響應(yīng)值且不影響離子化。鰻魚中6種待分析物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2，因為在不同的6個通道中監(jiān)測，所以各四環(huán)素類藥物的豐度在優(yōu)化過的質(zhì)譜條件下可以達到一致，出峰時間不會相互產(chǎn)生干擾。

表4 加標(biāo)回收實驗結(jié)果(n=5)Table4 Recoveries and RSDs of six tetracylines in spiked eel muscle (n=5)

2.4 方法性考察

在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下，用樣品空白溶液配制成一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進行測定，進樣量10μL，以各化合物峰面積(Y)對各四環(huán)素含量(X，μg/kg)繪制工作曲線，其線性范圍、線性方程和線性相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，UPLC-MS/MS分析方法測定四環(huán)素類藥物，在5.0～50.0μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)在0.9969～0.9999之間，滿足定量要求。以每種四環(huán)素類藥物峰高的信噪比大于5確定為方法的檢出限(LOD)，信噪比大于10確定為定量下限(LOQ)。6種四環(huán)素類藥物殘留的LOD均為2.5μg/kg，LOQ均為5μg/kg。

表3 6種四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n=5)Table3 Figures of merit of standard curves of six tetracylines (n=5)

選擇4種添加水平，以鰻魚作為空白基質(zhì)進行測定，結(jié)果(表4)表明該方法回收率高，平均回收率范圍為61%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～5.7%。

3 結(jié) 論

本實驗建立水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物多殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法，該方法試劑用量小，具有良好的凈化效果和重現(xiàn)性，其定量下限為5μg/kg，能夠滿足世界各國對水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的限量要求，適用于鰻魚和蝦等水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的定性和定量分析。

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Determination of Tetracycline Residues in Aquatic Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIN Jing，ZHANG Jin-hu，ZHENG Yu，YANG Yong，YU Chai，WU Wen-fan
(Fuqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuqing 350300, China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of six tetracylines in aquatic products. Samples were extracted with 0.01 mol/L Na2EDTA/ Mcllvaine buffer solution. After filtrated and degreased by n-hexane, the extract was passed through Oasis HLB solid phase extraction column and eluted with methanol, and the eluate was then pooled together and evaporated until dryness under nitrogen and redissolved in 1.0 mL of dissolving solution. The solution was separated on a RP-UPLC column and detected by triplequadrupole MS. The electrospraying was operated in the positive ionization mode and the identification of analytes was achieved using multiple reaction monitoring (MRM) mode. Quantitation was carried out using the external standard method. The standard curves for all the compounds were linear over the concentration range of 5.0 to 50.0μg/kg with correlation coefficients between 0.9969 and 0.9999. The spike recoveries at four levels of 5.0, 10.0, 25.0, 50.0μg/kg ranged form 61% to 97%, and the relatives standard deviations (RSD) were in the range of 1.3% to 5.7%. The limits of detection of the method for the analytes were all 2.5μg/kg. Owing to the merits of simplicity, selectivity and sensitivity, the proposed method has been successfully applied to the determination of tetracyclines in aquatic products.

aquatic products；tetracyclin antibiotics；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC- MS/MS)

O657.63

A

1002-6630(2010)20-0286-04

2010-01-07

福建出入境檢驗檢疫局科技項目(FK2008-18)

林荊(1980—)，女，工程師，碩士，研究方向為化學(xué)分析。E-mail：r3osy@sina.com