邱小明，劉志瓊

?

慶大霉素產生菌的基因工程育種

邱小明1，劉志瓊2

（1.漳州職業(yè)技術學院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.上海皚博生物科技有限公司，上海 201620）

研究小單孢菌產抗生素的生物合成機理，利用基因克隆方法從棘孢小單孢菌（）中克隆出產慶大霉素生物合成的關鍵酶基因—2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因（gntB），并將其通過大腸桿菌――鏈霉菌穿梭質粒pIJ699轉化原菌株，采用硫鏈絲菌素抗性基因啟動子帶動2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因表達,在培養(yǎng)條件不變的情況下重組菌產抗率較原菌株提高3.5％。

棘孢小單孢菌；2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因；產素率；pIJ699；表達CLC Q78

氨基糖苷類抗生素是重要的抗感染藥物，而小單孢菌是氨基糖苷類抗生素的重要產生菌，如產慶大霉素的棘孢小單孢菌和絳紅色小單孢菌；產西索米星的伊尼奧小單孢菌等。多年來，人們采用傳統(tǒng)的育種手段來改造小單孢菌的生物合成,但是收效甚微。幾種小單孢菌合成抗生素的水平(如慶大霉素,西索米星等)遠遠低于由鏈霉菌所產的抗生素(如鏈霉素和四環(huán)素等)[1]。

而基因工程育種可以按照人們事先設計和控制的方法進行育種，是一種最新、最先進的育種技術。隨著人們對抗生素生物合成基因以及調控基因的深入了解,人們可以在分子水平上改造微生物使它們過量合成抗生素。通過提高限速步驟酶活力或過量合成限速步驟酶[2]或增加其自身對抗生素抗性[3]的方法來提高微生物合成抗生素的產量。

近年來,隨著分子生物學的發(fā)展,很多臨床上重要的抗生素的生物合成基因已被確定,例如β-內酰胺類抗生素(青霉素類、頭孢菌素類)、多肽類抗生素(短桿菌肽等) 、多聚酮類抗生素(大環(huán)內酯類、四環(huán)類)。雖然對臨床上應用非常廣泛的氨基糖苷類抗生素的生物合成基因研究還較少,但幾種小單孢菌產生抗生素的生物合成基因簇已被確定，如棘孢小單孢菌和絳紅色小單孢菌生物合成慶大霉素的基因簇[4-6]等，同時確定2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因（gntB）是合成慶大霉素基因簇中的一個關鍵酶基因[7]。

本實驗從棘孢小單孢菌基因組中擴增出gntB基因，嘗試用鏈霉菌表達性質粒pIJ699轉化原菌株（棘孢小單孢菌），使gntB得到過量表達，以期提高棘孢小單孢菌產慶大霉素的水平。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

棘孢小單孢菌菌株由福建師范大學贈送；DH5α、質粒pBS－T購自天根公司；質粒pIJ699由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院陳代杰教授饋贈。

1.2 工具酶及試劑

實驗所需限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、4種dNTP Mixture等均為NEB公司產品，DNA凝膠回收試劑盒為杭州博日公司產品，溶菌酶、蛋白酶K、RNase為上海生工產品，DNA標樣為TaKaRa公司產品。

1.3 抗生素：氨芐青霉素（Amp）、硫鏈絲菌素（Tsr）、新霉素（Neo）購自華美公司。

1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB(Luria-Bertain)培養(yǎng)基：Trypton 1.0％、Yeast Extract 0.5 ％、NaCl 1.0％，pH 7.4，121℃高壓滅菌 20min。若為固體培養(yǎng)基，則另外加入1.7％的瓊脂。根據(jù)需要添加氨芐青霉素(終濃度50～100μg/ml)和新霉素(終濃度50μg/ml)。

棘孢小單孢菌種子搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：黃豆餅粉 20，玉米粉25，蛋白胨 5，KNO30.5，CaCO34，葡萄糖1，pH 7.2，35℃，220r/min,培養(yǎng) 36h左右。

棘孢小單孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 20 ,黃豆餅粉 20 ,蛋白胨 5，葡萄糖5, CaCO34, MnSO4. 0.0001, CoCl20.001, pH 7.8。35℃，220r/min ,培養(yǎng) 120h。

棘孢小單孢菌原生質體制備培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 20 ,黃豆餅粉 20 ,蛋白胨 5，葡萄糖5，CaCO34，MnSO4.0.0001，CoCl20.001，Gly 3，pH 7.8，35℃，220r/min培養(yǎng)48h。

棘孢小單孢菌原生質體再生培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 40，蔗糖：103，MgCl210, KNO31, K2HPO40.3, MgSO40.5, NaCl 0.5, CaCO31,天冬素0.02，麩皮30，瓊脂15，pH 7.6～7.8，35℃培養(yǎng)10天左右。

1.5 緩沖液

P緩沖液、轉化緩沖液的配制[8-9]。

1.6 操作方法

1.6.1DNA的操作方法[10-11]

主要有染色體DNA的提取與純化、質粒DNA的提取與純化、DNA的酶切、連接、轉化等操作。

1.6.2原生質體的制備[8-9]

2 結果

2.1 引物的設計及gntB的克隆

從Genbank中查出棘孢小單孢菌產慶大霉素生物合成基因簇中2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因（gntB）作為引物設計的參考模板(AY524043)，設計、合成一對簡并引物。

上游引物P1為：CCATGGAGGT CGAGATACGCC ()；

下游引物P2為：CGTCAACCAT CGGCAGCACC ()。

上、下游引物各包含了一個酶切位點，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

2.2 GntB基因的克隆

表1 PCR反應體系

抽提棘孢小單孢菌的染色體DNA作為模板，按表1將各成分在無菌的200μl eppendorf管中混合，裝樣量為30μl，在PCR自動擴增儀中進行擴增。PCR運行循環(huán)條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸2min，循環(huán)30次，最后72℃保溫10min。

按照上述反應條件在PCR儀中擴增gntB，再用濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠走電泳，結果如圖1。經測序,確定擴增片斷是2-脫氧青蟹肌糖合成酶基因。

圖1 從棘孢小單孢菌基因組中擴增gntB基因的電泳圖

M:1kb DNA Marker;

1～5:gntB基因PCR產物

圖2 重組質粒pBS-T-gntB 酶切鑒定電泳圖

M:1kb DNA Marker1:pBS-T-gntB重組質粒；

2～3:pBS-T-gntB質粒酶切（）

2.3 含gntB基因的大腸桿菌――鏈霉菌穿梭質粒的構建

2.3.1 pIJ699

目前小單孢菌的克隆系統(tǒng)缺少合適的載體，而鏈霉菌屬含有大量的野生型質粒，其中pIJ699是大腸桿菌/ 鏈霉菌穿梭質粒,它是一個含有pIJ101型鏈霉菌復制子和p15A型大腸桿菌復制子的正選擇穿梭載體質粒，它是一種提供正選擇的質粒載體,同時含有用于鏈霉菌轉化系統(tǒng)的篩選標記硫鏈絲菌素抗性基因以及用于大腸桿菌轉化系統(tǒng)的篩選標記紫霉素抗性基因（）和新霉素抗性基因（）。它被和雙酶切后產生一條5kb片段,是含有鏈霉菌復制子,兩端為回文序列的線性化載體片段,當含有鏈霉菌復制子載體片段與外源DNA 片段連接后重組時,質粒才能正常復制并使宿主菌產生抗性,而自身環(huán)化的載體由于兩回文序列沒被隔開而無法復制,所以轉化子均攜帶有外源DNA片段[12]。所以我們嘗試用pIJ699來攜帶gntB轉化棘孢小單孢菌原生質體。

2.3.2 pIJ699－gntB重組質粒的構建

將gntB基因與載體pBS－T連接,構建pBS-T-gntB重組質粒,然后轉化DH5α感受態(tài)細胞,培養(yǎng)、篩選重組菌,抽提、鑒定重組質粒，再用內切酶酶切，電泳，結果如圖2所示，回收1193bp片斷。

同時將質粒pIJ699 轉化DH5α感受態(tài)細胞，使其得到擴增，再用內切酶和雙酶切，回收5kb（）片斷。并將其與上述回收的gntB基因（）連接，得到pIJ699－gntB重組質粒。具體過程如圖3所示。

2.4 PEG介導的原生質體轉化以及重組菌的篩選

取12.5μl新鮮制備的棘孢小單孢菌原生質體懸液（1～5 ×1010個/ml）、10μl質粒DNA溶液和40μl P緩沖液，依次加入到一無菌的1.5ml Eppendorf管中,室溫靜置1min，然后加入含有25 %（vol/vol）PEG1000的轉化緩沖液，吹吸混勻,30℃水浴加熱30分鐘。反應結束加入200μl P緩沖液稀釋，再3500rpm離心10分鐘,棄部分上清,取100μl涂布于原生質體再生培養(yǎng)基（平板表面無冷凝水，雙層：下層為再生培養(yǎng)基，上層為5ml含有25μg/ml硫鏈絲菌素的再生培養(yǎng)基），35℃培養(yǎng)10天后檢測轉化子（由于可能存在的質粒不相容性，所以我們選擇去除內源性質粒的棘孢小單孢菌作為轉化對象）。

經過10天左右的培養(yǎng)，從原生質體再生平板上挑選轉化子，并進行培養(yǎng)、抽提質粒、酶切、電泳鑒定，電泳結果如圖3所示。

從圖4 可以看出pIJ699－gntB被成功地轉化到去除內源性質粒的棘孢小單孢菌中去。

圖3 重組質粒pIJ699－gntB的構建

圖4 重組質粒 pIJ699-gntB 的酶切產物電泳圖

M:1kb DNA Marker; 1：酶切pIJ699-gntB重組質粒 2：重組質粒 pIJ699-gntB

2.5 重組菌發(fā)酵,效價測定

將獲得的轉化了pIJ699-gntB的重組菌挑選單菌落接入到棘孢小單孢菌的斜面培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)7天.再挖塊接入種子搖瓶中,培養(yǎng)36～48h（待種液顏色變?yōu)槲⒓t）后轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中 (共10瓶)，35℃，220rpm/min培養(yǎng)120h，酸化、過濾，測定慶大霉素效價,數(shù)據(jù)如表2所示(同時在相同條件下做10瓶去除質粒的原始菌株發(fā)酵搖瓶作為對照)。從表2得出棘孢小單孢菌重組菌的發(fā)酵效價較原始菌株提高了3.5％。

表2 棘孢小單孢菌重組菌與原菌株發(fā)酵效價的比較

3 討論

由于標準曲線的制定、發(fā)酵液效價的測定等都存在一定的誤差，重組菌發(fā)酵效價較原菌株提高 3.5％也在這個誤差范圍之內，所以不能確定gntB在重組菌中是否得到了表達?？赡艽嬖谌缦聨追N可能：

（1）外源gntB基因得到了表達

在重組菌中外源基因gntB得到了表達，但是表達的效率不高，致使慶大霉素的產素能力沒有得到較大幅度提高。

重組菌的表達受很多因素的影響，如溫度、供氧量、誘導劑等，在大腸桿菌中表達外源基因經常用低溫和加入IPTG等誘導劑的方法誘導其表達，在重組酵母中也經常用甲醇來誘導外源基因表達，但由于在小單孢菌中表達外源基因目前尚無報道，也沒有關于2-脫氧青蟹肌糖合成酶酶活測定方法方面的報道，因此無法選擇合適的誘導劑誘導表達或通過測定重組菌2-脫氧青蟹肌糖合成酶酶活來直接判斷gntB基因是否得到了表達。

（2）外源基因gntB沒有得到表達

在重組菌中外源重組質粒pIJ699－gntB也可能沒有得到表達，因為pIJ699是鏈霉菌－大腸桿菌的穿梭質粒，可能在小單孢菌中無法使攜帶的外源基因gntB得到表達。

（3）部分重組菌可能發(fā)生質粒丟失情況

為了提高重組菌培養(yǎng)時質粒的穩(wěn)定性，首先將其接到種子培養(yǎng)基中生長成菌絲，再轉接到含25μg/ml硫鏈絲菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導外源基因表達，測定發(fā)酵液產素水平，發(fā)現(xiàn)沒有多大變化。

因此推斷可能是重組質粒pIJ699－gntB在目前的培養(yǎng)條件下沒有得到充分表達，或者是外源基因gntB通過鏈霉菌表達載體pIJ699在棘孢小單孢菌中不能表達所致。但本工作已進行了嘗試，為今后的小單孢菌的基因重組積累了經驗，奠定了基礎。

[1]洪文榮，陳代杰,劉靖,等. 依尼奧小單孢菌抗性基因sisR 的克隆研究[J].生物工程學報，2005，21(1):149－153.

[2]程杉，夏煥章.氨基糖苷類抗生素生物合成基因研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2003，20(1)：60－64.

[3]Haifeng H, Kozo O. Novel Approach for Improving the Productivity of Antibiotic-Producing Strains by Inducing Combined Resistant Mutations[J]., 2001, 67(4):1885－1892.

[4]Kelemen GH,Financse kI,Jarai M.Efficient transformation ofwith pIJ702 plasmid[J].,1989, 42(2):325－328.

[5]Kelemen GH,Cundliffe E,FinancsekI.Cloning and characterization of gentamicin-resistance genes fromand[J].,1991,98(1):53－60.

[6]Jamie U, Scott S, Dylan A, Thomas H, Annc H, Elizabeth M H W.Gene Cluster inATCC15835 for the Biosynthesis of the Gentamicin C Complex [J] ., July 2004,57(7):436－445.

[7]Madan K，Kharel, Devi B，Basnet, Hei Chan Lee, Kwangkyoung Liou, Young Ho Moon1, Jae-Jong Kim1, Jin Suk Woo, Jae Kyung Sohng. Molecular Cloning and Characterization of a 2-Deoxystreptamine Biosynthetic Gene Cluster in Gentamicin-producingATCC15835[J].,2004, 18(1):71－78.

[8]Susan F. Love, William M. Maiese, David M. Rothstein. Conditions for Protoplasting, Regenerating, and Transforming the Calicheamicin Producer,[J]., 1992, 58(4):1376－1378.

[9]Mamoru H, Tohru D, Toshio O, ERI Hashimoto. A Novel, Highly Efficient Gene-Cloning System for Micromonospora Strains[J]., 1991, 173(21):7004－7011.

[10]黃培堂，等譯.分子克隆實驗指南[M].北京:科學出版社,2002：723－1356.

[11]鄧子新,唐紀良譯.鏈霉菌遺傳操作實驗手冊[M].長沙:湖南科學技術出版社, 1988：81－134.

[12]Susan F. Love, William M. Maiese, David M. Rothstein. Conditions for Protoplasting, Regenerating, and Transforming the Calicheamicin Producer,[J]., 1992, 58(4):1376－1378.

Genetic engineering breeding of Gentamicin producing trains

QIU Xiao-ming1，LIU Zhi-qiong2

（1.Foods and biology engineering department, Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhangzhou 363000,China; 2.Shanghai Kaibo Biotechnology limited Co., Shanghai 201620,China）

The biosynthetic mechanism of producing antibiotic by some members of the actinomycete genus micromonospora was studied.Using the gene-cloning method to clone the key enzyme gene of gentamicin biosynthesis （gntB）from micromonospora echinospora through a E. coli－Streptomyces shuttle plasmid pIJ699. One clone harboring a plasmid that contains gntB was obtained from selectivity culture medium. Exterior gntB was driven by Promoter of Thiostrepton resistance gene in Micromonospora echinospora. The rate of gentamicin production was enhanced by 3.5% under the same cultivating condition.

Micromonospora echinospora；gntB；The rate of production；pij699；expression CLC Q78

2010－07－24

邱小明（1979－），男，助教，碩士，研究方向：生物技術與生化反應工程。

R764

A

1673-1417（2010）03-0069-05