劉躍銀，夏 紅

（1.郴州市第二人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001）

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物，學(xué)名為三葉崖爬藤(Tetrastigma Hemsleyanum Diels et1Gilg)。主要分布于浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等省區(qū)[1]。三葉青的塊根或全草均可入藥,具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效，用于治療高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝炎、風(fēng)濕、月經(jīng)不調(diào)、咽痛、瘰疬等癥，具有很好的療效[2]。藥物藥理學(xué)研究表明三葉青提取物有抗病毒作用和明顯的消炎鎮(zhèn)痛[3]以及抗腫瘤作用[4]。程偉等[5]在研究三葉青抗腫瘤活性機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)：三葉青提取物誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞DNA發(fā)生核小體間斷裂，DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)"梯狀"條帶。本文的研究目的是觀察三葉青乙酸乙酯提取物 (ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg,EAFT)誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡作用，并初步探討其作用分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 受試物與試劑

三葉青購自湖南醫(yī)藥有限公司(中國長沙)。三葉青提取物參照文獻(xiàn)[6]描述的方法，采用乙酸乙酯提取法獲得。紫杉醇(TAX)，北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：30mg/5mL/支，批號(hào)：080830。RPMI-1640培養(yǎng)基 (Invitrogen公司)、小牛血清(Invitrogen公司)、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒 (碧云天公司)細(xì)胞死亡ELISA檢測試劑盒(羅氏公司)和小鼠抗人Bax和細(xì)胞色素C抗體((Santa Cruz Biotechnology公司))購自湖南科泰生物技術(shù)有限公司(中國長沙)。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (中國武漢市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 FITC標(biāo)記Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析

取經(jīng)藥物或溶媒處理的HT-29細(xì)胞1×106，1000g離心5min，棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)和5μL Annexin V-FITC，室溫(20～25℃)避光孵育10 min。然后，1000g離心5min，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)和10μL碘化丙啶染色液，混勻，立即用EPICS XL流式細(xì)胞儀(美國COULTER公司)檢測Annexin V-FITC陽性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI雙染陽性(晚期凋亡)細(xì)胞百分率。

1.4 組蛋白/DNA碎片的含量測定

參照細(xì)胞死亡ELISA檢測試劑盒 (羅氏公司)說明書描述的步驟操作，用EXL-800酶聯(lián)免疫檢測儀，以405nm波長測定吸光度(A)值。

1.5 免疫印跡分析

參照文獻(xiàn)[7]描述的方法，目的條帶經(jīng)薄層掃描儀(日本產(chǎn)，型號(hào)CS-930)掃描，Alphazmager2200軟件測定印跡區(qū)帶的光密度值。以Bax/β-actin和Cyto C/ β-actin的比值分別代表Bax或Cyto C蛋白表達(dá)水平，以DMSO組為1.00。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±s表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差具有齊性，用LSD法進(jìn)行多樣本均數(shù)之間的兩兩比較；方差不齊，采用Dunnet T3法進(jìn)行多樣本均數(shù)之間的兩兩比較。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAFT對HT-29細(xì)胞凋亡率的影響

圖1可見：EAFT誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞系A(chǔ)nnexin V-FITC陽性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI雙染陽性(晚期凋亡)細(xì)胞百分率增高，呈濃度依賴性(P＜0.01)。

AnnexinⅤ-FITC/PI雙染FCM分析細(xì)胞凋亡率。A：3此獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中1次實(shí)驗(yàn)的典型圖像。B：3次實(shí)驗(yàn)的mean±s；與溶媒組比較,**P＜0.01；與溶媒組比較，***P＜0.001；與0.1mg/LEAFT處理組比較,##P＜0.01；與0.1mg/LEAFT處理組比較,###P＜0.001。

2.2 EAFT對HT-29細(xì)胞組蛋白/DNA碎片的影響

圖2示：EAFT以濃度依賴方式增加HT-29細(xì)胞組蛋白/DNA碎片(P＜0.05)。

ELISA法檢測細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平。3次實(shí)驗(yàn)的mean±s；與溶媒組比較,*P＜0.05；與溶媒組比較,***P＜0.001；與#0.1mg/LEAFT處理組比較,###P＜0.05；與0.1mg/LEAFT處理組比較,P＜0.001。

2.3 EAFT對HT-29細(xì)胞Bax表達(dá)的影響

Western Blotting分析表明：EAFT(10 mg/L)上調(diào)HT-29細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平，呈時(shí)間依賴性 (P＜0.01)。

Western Blot分析全細(xì)胞提取物Bax表達(dá)水平。圖示3次實(shí)驗(yàn)中1次實(shí)驗(yàn)的典型圖像，相對密度(Relative density)為3次實(shí)驗(yàn)的mean±s；與溶媒組比較,***P＜0.01；與溶媒組比較,**P＜0.001。

2.4 EAFT對HT-29細(xì)胞Cyto C表達(dá)的影響

Western Blotting分析證實(shí)：10 mg/L EAFT以時(shí)間依賴方式增加HT-29細(xì)胞Cyto C蛋白表達(dá) (P＜0.05)。

Western Blot分析細(xì)胞提取物Cyto c蛋白表達(dá)水平。圖示1次實(shí)驗(yàn)的典型圖像，相對密度(Relative density)為3次實(shí)驗(yàn)的mean±s；與溶媒組比較,**P＜0.05；與溶媒組比較,*P＜0.01。

3 討論

眾所周知，細(xì)胞凋亡早期具有一個(gè)重要的特征即位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻至細(xì)胞膜外側(cè)。磷脂酰絲氨酸能特異結(jié)合膜磷脂蛋白Ⅴ(annexinⅤ)。因此，流式細(xì)胞儀檢測的單純AnnexinⅤ-FITC染色陽性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞膜的通透性增高，DNA染料即PI能進(jìn)入細(xì)胞使細(xì)胞DNA發(fā)出熒光。因此，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色陽性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。同時(shí)，在細(xì)胞凋亡的晚期發(fā)生細(xì)胞基因DNA斷裂，形成組蛋白/DNA碎片，因此，細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平增高能反映晚期凋亡細(xì)胞增加。本文的研究結(jié)果首先證明，EAFT具有誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡作用；其主要證據(jù)有：1)EAFT以濃度依賴方式增加AnnexinⅤ-FITC染色和 (或)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色陽性的HT-29細(xì)胞數(shù)目；2)EAFT增高HT-29細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平。

線粒體在細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用越來越引起人們的重視。一方面由于線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)后觸發(fā)caspase級聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另一方面，線粒體外膜上的Bcl-2蛋白家族調(diào)控細(xì)胞色素C自線粒體釋放，凋亡過程中細(xì)胞色素C通過線粒體外膜釋放，在ATP/dATP參與下，在胞質(zhì)中與Apaf-1結(jié)合形成寡聚體，Apaf-1通過其氨基端和procaspase-9的功能前區(qū)相互作用，導(dǎo)致caspase-9激活，并進(jìn)一步激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)[8]。而Bcl-2蛋白家族是通過釋放細(xì)胞色素C執(zhí)行凋亡指令[9]。本文的Western Blotting分析結(jié)果顯示，EAFT以時(shí)間依賴方式上調(diào)HT-29細(xì)胞Bax和cyto C蛋白表達(dá)水平。說明，EAFT可能通過激活線粒體凋亡誘導(dǎo)途徑導(dǎo)致結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們的結(jié)果證實(shí)：中國特有植物三葉青的乙酸乙酯提取物 (EAFT)能有效誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制涉及激活線粒體凋亡誘導(dǎo)途徑。提升了EAFT作為人結(jié)腸癌候選藥物的可能性。

[1]中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1984.219.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典 [M].上海:上海人民出版社, 1977.2123.

[3]Zi GM,Ji L,Hu JC,et al.Studies of anti-inflammatory action and analysis of hemsley reckvine(Tetrastigma hemsleyanum) [J].Chin Tradit Herb Drugs,1980,11(4):145-146.

[4]倪克鋒,丁志山,黃挺,等.三葉青黃酮對H-22荷瘤小鼠瘤體的抑制作用及其機(jī)理研究 [J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,32(6):732-734.

[5]程偉,陸曙梅.三葉青提取物對肺癌A549細(xì)胞的體外抑制作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007,13(10):53-56.

[6]Xu CJ,Ding GQ,Fu JY,et al.Immunoregulatory effects of ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg on immune functions of ICR mice [J].Biomed Environ Sci,2008,21(4):325-331..

[7]王春燕，劉逸，楊勝圓，等.H2O2通過上調(diào)p38的活性而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009,6 (3):22-25.

[8]高建新,周玉琴,張茹華,等.Caspase-3在roscovitine誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用 [J].生理學(xué)報(bào),2005,57(6): 755-760.

[9]方稀敏，陳銘珍，陳日玲等，細(xì)胞色素C對HL-60細(xì)胞凋亡作用及其與相關(guān)bcl-2、bax基因的關(guān)系[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005，13（4）：570-574.