陶曉宇，曾 瑜，段 答，劉 波，趙振宇，滕曉華，盧 明★

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410006；2.湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長(zhǎng)沙410003）

臍血又稱胎盤血或臍帶血，是胎兒出生時(shí)臍帶和胎盤近胎兒側(cè)血管內(nèi)的血液。2000年Erice[1]報(bào)道臍血中含有大量間充質(zhì)干細(xì)胞祖細(xì)胞 (mesenchymalstem cell/mesenchymalprogenitorcell, MSC/MPC)。臍血MSC/MPC與骨髓MSC類似，具有多向分化潛能，可在一定條件下分化為骨細(xì)胞、軟細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞。同時(shí)，臍血MSCs具有以下優(yōu)點(diǎn)：①來(lái)源豐富，易于獲?。虎诓杉奖?，對(duì)供者無(wú)痛苦；③免疫系統(tǒng)處于原始階段，移植后免疫排斥反應(yīng)??；④避免社會(huì)倫理和法律問(wèn)題；⑤具有更強(qiáng)的增殖、分化能力。因此臍血MSC可能成為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種很好的細(xì)胞來(lái)源，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。本試驗(yàn)利用嗅鞘細(xì)胞上清液誘導(dǎo)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況，為臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

新生SD大鼠(出生第5天)10只(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清FBS(Hyclone)，胰蛋白酶和膠原蛋白酶(Gibco)，L-多聚賴氨酸(Sigma)，阿糖胞苷(Ara-c)(Sigma)，兔抗人NSE(Sigma)，鼠單克隆抗體GFAP、小鼠二步法檢測(cè)試劑盒 (中彬金橋生物工程有限公司)，D-Hank's液和0.01 mol/L PBS均為本實(shí)驗(yàn)室配制，離心管和50 mL玻璃培養(yǎng)瓶，解剖顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

臍血取自湖南省婦幼保健醫(yī)院足月剖宮產(chǎn)的臍帶血，均經(jīng)父母授權(quán)同意。無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶血約60 mL，肝素(20 U/mL)抗凝，加等體積無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋、輕輕搖勻。采用密度梯度離心法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs)：按3:2的比率加入有淋巴細(xì)胞分離液的試管中，2500 r/min水平離心25 min(離心半徑為16 cm)。試管內(nèi)液體分為四層，吸取中間的白膜層。加入3～5倍體積的PBS緩沖液稀釋，1000r/min離心洗滌10 min后棄上清液，再以同樣方法離心洗滌一次。臺(tái)盼藍(lán)染色、光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用MesenCult培養(yǎng)液調(diào)整至1.0× 106/mL的細(xì)胞密度用于細(xì)胞培養(yǎng)。置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，24h后，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3～5天半量換液一次。待細(xì)胞達(dá)到80%時(shí)，用0.125%的胰酶消化，然后按1:3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代。傳代培養(yǎng)過(guò)程中每3天半量換液一次，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復(fù)上述操作，傳代培養(yǎng)記為P2代，其余類推，傳代到P3代。

1.3 大鼠嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)

選用新生1～2天的SD大鼠10只，放入絡(luò)合碘中浸泡消毒15min，在超凈臺(tái)內(nèi)顯露兩側(cè)嗅球，并將之完整取下，置于盛有PBS平衡鹽溶液的4℃冰浴的培養(yǎng)皿中,在解剖顯微鏡下仔細(xì)去除嗅球表面的毛細(xì)血管和軟腦膜，取下纖維層和嗅小球?qū)?，用眼科剪剪碎?.25%的胰蛋白酶 37℃消化 15 min，DMEM(含10%胎牛血清)終止消化，巴氏吸管吹打后用80μm的細(xì)胞篩過(guò)濾，離心濾液 (1000 r/ min，10 min)，棄上清，DMEM(含10%胎牛血清)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞以5×104/mL接種于無(wú)包被的玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1h后輕輕振蕩培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細(xì)胞懸液重新種植到令一無(wú)包被的玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，8h后再將未貼壁的細(xì)胞懸液接種到用另一個(gè)用多聚賴氨酸包被的玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，24 h后加入終濃度為2 mg/L的AraC，24 h后全量換液，并用PBS洗一遍，除去AraC的作用，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天半量換液一次。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到大約80%時(shí)吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無(wú)血清DMEM)。孵育24 h后收集條件培養(yǎng)液。-20℃保存條件培養(yǎng)液。

1.4 誘導(dǎo)分化

分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組：取P3代MSCs按6×1/mL接種到事先放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片六空板內(nèi)，24 h后用OECs無(wú)血清上清液培養(yǎng)，2天半量換液一次。對(duì)照組：用OECs培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.5 免疫組化鑒定

采用 SABC改良法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，取誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，0.01 mol/L PBS沖洗，加一抗4℃過(guò)夜，生物素化二抗室溫孵20 min，鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物室溫孵育 10 min，DAB顯色 3～5min，陰性對(duì)照不加一抗，光鏡下棕色細(xì)胞為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

3～4h部分細(xì)胞貼壁，24h后大量細(xì)胞貼壁，散在分布，呈圓形，3～4d后開始逐漸伸出突起,折光性好,逐漸在局部形成集落生長(zhǎng),以梭形細(xì)胞為主，胞漿豐富，核大，細(xì)胞平行或呈漩渦狀盤旋排列；7～9d以后MSCs迅速擴(kuò)增,約2～3周后可達(dá)80%～90%融合,擴(kuò)增變緩,即可傳代，并依次傳至第三代P3(如圖1)。

2.2 嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)、觀察和免疫組化鑒定

體外培養(yǎng)，OECs呈橢圓形、梭形、三角形，折光性強(qiáng)，突起細(xì)長(zhǎng)(圖2A)，培養(yǎng)第9天p75染色見大量陽(yáng)性細(xì)胞(圖2B)。

2.3 細(xì)胞形態(tài)

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24h后細(xì)細(xì)胞體收縮，形成圓形、錐形、三角形，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，胞質(zhì)逐漸回縮，呈典型的核周形態(tài)，逐漸長(zhǎng)出突起，并逐漸變細(xì)變長(zhǎng)，有的末端發(fā)出分支，類似樹突、軸突，突起與突起之間連接成網(wǎng)，類似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣的形態(tài)(圖3,4)。誘導(dǎo)后14天用神經(jīng)元標(biāo)志物NSE和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP鑒定，絕大部分細(xì)胞呈染色陽(yáng)性(圖5,6)。

對(duì)照組培養(yǎng)后呈多形態(tài)(圖7)：有破骨樣細(xì)胞，胞體較大,多個(gè)核,圓形,有成纖維樣的長(zhǎng)梭形細(xì)胞,單個(gè)核,有較長(zhǎng)的突起,折光性強(qiáng)。培養(yǎng)7天后，NSE和GFAP鑒定無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞。

3 討論

用于移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的干細(xì)胞來(lái)源有胚胎腦組織、骨髓、臍血以及脂肪組織，其中MSCs被認(rèn)為是良好的干細(xì)胞來(lái)源。自Sanchez和Buzanska等[2，3]報(bào)道了臍血MSCs體外可被誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，近來(lái)，用臍血間充質(zhì)干細(xì)胞作為神經(jīng)元來(lái)源替代凋亡或受損的神經(jīng)細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)[4,5]。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞能改善中風(fēng)、脊髓損傷、阿爾茨海默病和尼曼病的神經(jīng)功能以及替代神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[6-9]。Ende等[10]證實(shí)人臍MSCs移植可明顯改善老年癡呆和亨廷頓氏病的癥狀。目前，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子、抗氧化劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、香丹注射液等都有誘導(dǎo)臍血MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用[11-14]，但目前還沒有一種十分高效、可行的誘導(dǎo)方法。而且，有報(bào)道解釋說(shuō)那些化學(xué)試劑誘導(dǎo)表型改變的一個(gè)合理解釋是一種細(xì)胞毒性而不是一種分化[15]。因此，目前如何能在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增臍血間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化成更多的受限制的神經(jīng)細(xì)胞類型以便在結(jié)構(gòu)和功能上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損區(qū)整合成為研究的重點(diǎn)。

OECs是一種特殊類型的膠質(zhì)細(xì)胞，多項(xiàng)研究[16,17]發(fā)現(xiàn)鑒定了OECs分泌蛋白組中大量與神經(jīng)生長(zhǎng)和再生相關(guān)的蛋白，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (BDNF),膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3、4(NT3、NT4),膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(GGF2)和層粘連蛋白(Laminin)等。Wen等[18]利用嗅鞘細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)其分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，通過(guò)nestin、NSE、MAP2、GFAP和P75免疫組化和RT-PCR鑒定鑒定了分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)，能有效向神經(jīng)細(xì)胞分化。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，利用嗅鞘細(xì)胞上清液對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得較高神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化比例，通過(guò)對(duì)NSE、GFAP等分子標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞不僅神經(jīng)樣細(xì)胞樣形態(tài)，同時(shí)具備和表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。Quirici等[19]認(rèn)為MSCs的表面存在低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(LNGFR)。生長(zhǎng)因子受體都具有酪氨酸酶活性,當(dāng)生長(zhǎng)因子與相應(yīng)受體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)一系列的蛋白激酶激活，可以使許多蛋白底物磷酸化,最終引起早期的即刻基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞增殖、分化等效應(yīng)。

本研究通過(guò)新生大鼠嗅鞘細(xì)胞無(wú)血清上清液誘導(dǎo)MSCs,通過(guò)對(duì)NSE、GFAP等分子標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)分析,證實(shí)了在體外培養(yǎng)條件下,新生大鼠嗅鞘細(xì)胞無(wú)血清上清液可定向誘導(dǎo)臍血源MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞方向分化。但誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞的具體分子結(jié)構(gòu)及電生理特性和誘導(dǎo)分化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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