劉 斌,童春義

(湖南大學(xué)生物學(xué)院,湖南長沙 410082)

多囊腎(ADPKD)是一種由PKD1和PKD2突變引起的發(fā)病率在1/400～1/1000的常染色體顯性遺傳病,臨床癥狀主要表現(xiàn)為腎囊腫的出現(xiàn)和腎功能喪失[1-3].研究表明:囊腫生長除了與基因突變相關(guān)外[1],還與囊腫上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子表達(dá)水平有著密切聯(lián)系[4-6];此外,囊腫的生長和轉(zhuǎn)移還依賴于周圍新生血管的形成[7],因此通過阻斷血液供應(yīng)抑制囊腫生長的方法為多囊腎治療提供了一條新的思路.

已有研究表明:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體參與多囊腎囊腫周圍新生內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡[6-8],抑制受體VEGFR2表達(dá)能有效降低ADPKD細(xì)胞分泌VEGF的能力和細(xì)胞侵襲能力[8-10],然而關(guān)于直接抑制VEGFR2對(duì)囊腫形成的研究報(bào)道較少.為此,本文采用shRNA技術(shù)靶向性抑制多囊腎細(xì)胞中的VEGFR2表達(dá),結(jié)合3-D培養(yǎng)技術(shù)建立多囊腎模型,來進(jìn)一步考察VEGFR2表達(dá)抑制對(duì)多囊腎囊腫生長發(fā)育的影響,并對(duì)該基因作為治療靶點(diǎn)的可能性進(jìn)行初步探討.

1 材料和方法

1.1 材料

CRL2830細(xì)胞購自ATCC;I型膠原蛋白購自BD Biosciences公司;經(jīng)篩選后的VEGFR2 shRNA購自O(shè)pen Biosystems公司(Huntsville,AL);VEGFR2抗體、β-actin抗體、羊抗兔二抗和ECL顯影試劑盒購自美國Santa Cruz公司;VEGFR2上游引物為:5'-CTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACT-3',下游引物為5'-TGGTCATCAGCCCACTGGAT-3';內(nèi)對(duì)照GAPDH上游引物為:5'-AACGACCCCTTCAT TG AC-3',下游引物序列為:5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染

CRL2830細(xì)胞在含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng).當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí),用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗2～3遍,每孔加入含3 μ g VEGFR2 shRNA、3 μ L Lipofectamine 2000脂質(zhì)體和10 μ L無血清培養(yǎng)基的混合液進(jìn)行轉(zhuǎn)染,37℃孵育5 h后棄無血清培養(yǎng)基,換用含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

1.3 陽性克隆的篩選與鑒定

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后按1∶4的比例將細(xì)胞傳代,加入含600 mg/L G418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,每4 d換液一次,約2周后篩選得到陽性克隆,倒掉培養(yǎng)基,在顯微鏡下用記號(hào)筆將克隆圈出,用胰酶浸濕的小濾紙片在克隆上放置3～5 min后轉(zhuǎn)移到24孔板中繼續(xù)培養(yǎng),將長滿的細(xì)胞轉(zhuǎn)到35 mm培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng),維持培養(yǎng)基中G418濃度為600 mg/L,利用RT-PCR法和Western blot篩選VEGFR2低表達(dá)細(xì)胞克隆.

1.4 細(xì)胞生長曲線的測定

取各種對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按1×103/孔接種于96孔板,24 h后每日取3孔細(xì)胞,用血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù),取其平均值并繪制生長曲線.

1.5 3-D培養(yǎng)考察細(xì)胞cyst的生長速度

3-D細(xì)胞培養(yǎng)見參考文獻(xiàn)[11]并略作修改,將細(xì)胞懸浮液與終濃度為2 mg/mL的膠原蛋白混勻后加入24孔板的小孔中,置于37℃培養(yǎng)箱凝固30 min后,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每隔24 h將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下進(jìn)行囊腫的形態(tài)觀察和體積測定.

1.6 Western Blotting分析蛋白質(zhì)的表達(dá)

取各組細(xì)胞100 μ g全蛋白在不連續(xù)SDSPAGE膠中電泳,將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,麗春紅S染色檢測蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率,5%脫脂奶粉封膜2 h,TBS洗滌3次,加入一抗孵育8 h,TBS洗滌3次,加入二抗孵育3 h,TBS洗滌,用ECL免疫熒光印跡試劑盒顯色,曝光洗片,并重復(fù)3次.用Image J軟件對(duì)膠片進(jìn)行灰度分析,計(jì)算3種細(xì)胞中VEGFR2和β-actin蛋白的灰度比值.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 VEGFR2低表達(dá)的人CRL2830細(xì)胞系的建立和鑒定

從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測VEGFR2 shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CRL2830細(xì)胞VEGFR2表達(dá)水平影響,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見:轉(zhuǎn)染空白對(duì)照Scr-shRNA不影響細(xì)胞中的VEGFR2表達(dá),而轉(zhuǎn)染VEGFR2 shRNA后導(dǎo)致VEGFR2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著降低,其抑制程度接近70%(圖1);接著采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法考察了VEGFR2表達(dá)抑制對(duì)貼壁培養(yǎng)的3種細(xì)胞生長速度的影響,對(duì)不同細(xì)胞生長曲線(圖2)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)考察的3種細(xì)胞生長速度沒有明顯差異,提示VEGFR2沒有顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖的能力.

圖1 利用RT-PCR和Western blotting法檢測CRL2830細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染VEGFR2-shRNA對(duì)VEGFR2的表達(dá)影響Fig.1 The effect of shRNA transfection on VEGFR2 level of CRL2830 cells

圖2 不同VEGFR2表達(dá)水平的細(xì)胞生長曲線Fig.2 Growth curve of cells with different VEGFR2 expression

2.2 VEGFR2低表達(dá)誘導(dǎo)CRL2830細(xì)胞形態(tài)變化

雖然VEGFR2表達(dá)抑制沒有影響細(xì)胞的生長速度,但能引起細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的明顯變化,表現(xiàn)為VEGFR2低表達(dá)的細(xì)胞與細(xì)胞之間接觸變得疏松,細(xì)胞粘附能力顯著下降,細(xì)胞形態(tài)也由長梭形向多邊形變化,細(xì)胞核體積明顯增大,細(xì)胞容易呈團(tuán)狀生長(圖3);接著采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來考察VEGFR2表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響,在觀察時(shí)間內(nèi)(48 h)不同細(xì)胞之間的遷移速度沒有明顯差異,這表明VEGFR2表達(dá)變化未改變細(xì)胞遷移能力(結(jié)果略).

圖3 轉(zhuǎn)染VEGFR2-shRNA后CRL2830細(xì)胞的形態(tài)變化觀察(40×)Fig.3 Morphological change of CRL2830 cells transfected with VEGFR2-shRNA or not

2.3 膠原蛋白濃度對(duì)細(xì)胞囊腫形成的影響

用3-D方式培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn):在終濃度為2 mg/mL的膠原基質(zhì)中3種細(xì)胞均能形成規(guī)則的囊腫結(jié)構(gòu),基質(zhì)濃度為1.5～1.8 mg/mL時(shí),部分培養(yǎng)細(xì)胞形成囊腫結(jié)構(gòu),其他細(xì)胞則形成管狀結(jié)構(gòu);膠原濃度低于1.5 mg/mL時(shí)3種細(xì)胞均以管狀形式存在,無法形成規(guī)則的囊腫結(jié)構(gòu)(圖4).

圖4 膠原蛋白濃度對(duì)CRL2830細(xì)胞形成囊腫的影響(3 d)Fig.4 The influence of collagen concentration on cyst formation of CRL2830 cells(3 d)

2.4 VEGFR2低表達(dá)顯著降低囊腫的生長速度

將3種細(xì)胞分別培養(yǎng)在終濃度為2 mg/mL的膠原基質(zhì)中,顯微鏡下每天測量15個(gè)囊腫的直徑變化,并計(jì)算平均值.統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:在形成囊腫的前2 d,3種不同細(xì)胞形成的囊腫形狀和大小未表現(xiàn)出明顯差異;從第3 d開始,VEGFR2低表達(dá)細(xì)胞的囊腫直徑明顯小于對(duì)照細(xì)胞;至第5 d時(shí),低表達(dá)VEGFR2的囊腫直徑僅為對(duì)照囊腫直徑的50%(圖5為不同細(xì)胞形成囊腫的生長曲線,圖6為不同細(xì)胞形成的囊腫結(jié)構(gòu));低表達(dá)VEGFR2的囊腫細(xì)胞自第6 d開始大量凋亡,細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡特征,至第7 d細(xì)胞幾乎完全裂解;而對(duì)照組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和膠原蛋白濃度降低,球形囊腫結(jié)構(gòu)開始多個(gè)突起,并逐漸分化為管狀分支結(jié)構(gòu).

圖5 不同VEGFR2表達(dá)水平的CL2830細(xì)胞囊腫生長速度比較Fig.5 Comparison of growth speed of cysts formed by different CRL2830 cells

3 討 論

研究表明:各種細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子在多囊腎的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵的作用[5-6],如VEGF能通過自分泌、旁分泌方式與VEGFR2結(jié)合后刺激囊腫襯里上皮細(xì)胞分裂增殖,最終導(dǎo)致囊腫的發(fā)生及增大[7-8];此外,VEGFR2在囊腫血管生成和造血過程中也具有重要的生理功能,采用VEGF受體抑制劑SU5416切斷VEGF信號(hào)途徑后囊腫生長速度顯著降低,囊液中的VEGF含量顯著下降[12-13],這些研究結(jié)果提示了VEGFR2在多囊腎發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用.然而采用狗源性MDCK細(xì)胞和小鼠模型開展人多囊腎研究得到的結(jié)果無法真實(shí)地反映人源性多囊腎的發(fā)病過程[14].為此,本文以人源性CRL283細(xì)胞為材料,首次成功建立了人源性多囊腎細(xì)胞3-D模型,為該病的分子機(jī)制研究以及多囊腎治療和藥物開發(fā)研究提供了一種理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?

圖6 CRL2830、Scr-shRNA與VEGFR2-shRNA細(xì)胞形成囊腫的顯微成像結(jié)果(10×)Fig.6 The image of cysts formed by CRL2830、Scr-shRNA與VEGFR2-shRNA under microscope

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):抑制VEGFR2表達(dá)后雖然未影響貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的生長速度,然而細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變,形成的囊腫生長速度顯著低于對(duì)照細(xì)胞囊腫的生長速度,這與利用動(dòng)物模型得到的結(jié)果一致;此外還發(fā)現(xiàn):VEGFR2表達(dá)抑制能顯著誘導(dǎo)囊腫細(xì)胞早期凋亡并最終導(dǎo)致囊腫破裂;而抑制另外一種血管生成因子受體——VEGFR1后,囊腫生長速度以及細(xì)胞凋亡程度與對(duì)照組細(xì)胞幾乎沒有差異,為此推測:SU5416抑制多囊腎的進(jìn)程主要是通過抑制VEGF/VEGFR2信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的,靶向性抑制VEGFR2將成為有效治療多囊腎的有效手段之一.

[1] GRANTHAM J J.Clinical practice:Autosomal dominant polycystickidney disease[J].N Engl J Med,2008,359:1477-1485.

[2] WILSON P D,GOILAV B.Cystic disease of the kidney[J].Annu Rev Pathol,2007,2:341-368.

[3] KASPAREIT-RIT TINGHAUSEN J,DEERBERG F,RAPP K G,etal.A new rat model for polycystic kidney disease of humans[J].Transplant Proc,1990,22:2582-2583.

[4] STINGER K D,KOMERS R,OSM AN S A,et al.Gender hormones and the progression of experimental polycy stic kidney disease[J].Kidney Int,2005,68:1729-1739.

[5] ITO F,NAKAZAWA H,RYOJI O,et al.Cytokines accumulated in acquired renal cysts in long-term hemodialysis patients[J].Urol Int,2000,65:21-27.

[6] NICHOLS M T,GIDEY E,MATZAKOS T,etal.Secretion of cytokines and growth factors into autosomal dominant polycystic kidney disease liver cyst fluid[J].Hepatology,2004,40:836-846.

[7] FABRIS L,CADAMURO M,FIOROT TO R,et al.Effects of angiogenic factor overexpression by human and rodent cholangiocytes in polycystic liver diseases[J].Hepatology,2006,43:1001-1012.

[8] AM URA C R,BRODSKY K S,GROFF R,et al.VEGF receptor inhibition blocks liver cy st growth in pkd2(WS25/—)mice[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,293:419-428.

[9] ZAFAR I,TAO Y X,FALK S,et al.Effect of statin and angiotensin-converting enzyme inhibition on structural andhemodynamic alterations in autosomal dominant polycystic kidney disease model[J].Am J Physiol Renal Physiol,2007,293:854-859.

[10]TAO Y,KIM J,YIN Y,et al.VEGF receptorinhibition slows the progression of polycystic kidney disease[J].Kidney Int,2007,72:1358-1366.

[11]KANG T,YI J,YANG W,et al.Functional characterization of M T3-MMP in transfected MDCK cells:progelatinase a activation and tubulogenesis in 3-D collagen lattice[J].FASEB J,2000,14:2559-2568.

[12]SWEENEY W E,CHEN Y,NAKANISHI K,et al.T reatment of polycy stic kidney disease with a novel ty rosine kinase inhibitor[J].Kidney Int,2000,57:33-40.

[13]SPIRLI C,OKO LICSANYI S,FIO ROTT O R,et al.Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cy st g rowth in polycy stin-2-defective mice[J].Hepatology,2010,51:1778-1788.

[14]SHA LABY F,ROSSANT J,YAM AG UCHI T P,et al.Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice[J].Nature,1995,376:62-66.