黃國付，黃曉琳

(1.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科,湖北 武漢 430022；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,湖北 武漢 430030)

缺血性腦卒中為常見的腦血管疾病，致殘率和致死率均較高。對于大多數(shù)腦缺血患者而言，神經(jīng)元死亡不可避免，如何積極有效地促進缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能的恢復(fù)仍然是目前腦缺血的研究重點。前期研究表明，電針 （electro-acupuncture，EA）結(jié)合經(jīng)顱磁刺激（repetitive Transcranial Magnetic Stimulation，rTMS）治療能促進大鼠神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）的增殖，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[1]。本研究采用免疫組化進一步觀察電針結(jié)合rTMS對局灶性腦缺血大鼠不同時相、不同腦區(qū)神經(jīng)核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)表達的影響，以探討其在腦缺血神經(jīng)修復(fù)中的作用機制。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性清潔級Wistar大鼠120只，體質(zhì)量為(200±20)g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號:SCXR（鄂）2009-0007。

1.1.2 儀器 石蠟切片機(Leica 2025型，德國)，生物顯微鏡(Olympus BS-50型，日本)，CCD數(shù)碼相機(Canon 970型)，圖像分析系統(tǒng)(HPIAS21000)，G6805-1型電針治療儀(青島華青儀器廠)。

1.1.3 試劑 5-嗅脫氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine，BrdU）、小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體，免疫組化染色試劑盒包括生物素化抗小鼠抗體(二抗)、親和卵白素化過氧化物酶(三抗)均購于Sigma公司；小鼠抗大鼠NeuN單克隆抗體購于Vector公司;大鼠來源BrdU抗體購于Serotec公司；PBS、多聚賴氨酸、異硫氰熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的羊抗小鼠熒光二抗、Cy3標記的羊抗小鼠熒光二抗及SABC免疫組化試劑盒購于北京中山生物技術(shù)公司；正常山羊血清，DAB購于武漢BOSTER公司；去離子甲酰胺、TritonX-100、AEC試劑盒購于晶美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將120只動物隨機分為正常組、模型組、電針組、rTMS組和電針結(jié)合rTMS組(結(jié)合組)。參照廖維靖等[2]的大鼠大腦中動脈缺血模型造模方法，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型。術(shù)后24 h采用Bederson標準［3］初步評分并進行篩選。0分:未見行為缺陷; 1分:左前肢屈曲(提尾懸空實驗陽性);2分:側(cè)推抵抗力下降(側(cè)向推力實驗陽性)，伴左前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為;3分:同2分行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。選擇評分為1～3分的大鼠納入本研究。選取1 d作為開始治療的時間點，按7、14、28 d 3個時相點分為3個亞組，每個時相點取4只用于免疫組化檢測。

1.2.2 干預(yù)方法 正常組和模型組造模后當(dāng)日開始按同等條件抓取，但不實施電針及rTMS處理；電針組采用督脈電針的刺激方式，以橡皮筋將大鼠四肢固定在治療臺上，參照《實驗針灸學(xué)》[4]選取督脈經(jīng)穴“百會”、“大椎”，以30號1寸毫針斜刺入 “百會”10 mm，直刺入 “大椎”5 mm，將針柄分別連接至電針儀上，選取連續(xù)波，頻率為20 Hz，強度為1～2 mA。在手術(shù)2 h后即進行第1次治療，每次治療30 min，1次/d。rTMS組采用丹麥Dantec公司生產(chǎn)的磁刺激器及圓形線圈，線圈的直徑為12 cm，脈沖磁場的強度峰值為2T。刺激時固定大鼠頭部，線圈緊貼頭皮，與大鼠右側(cè)大腦半球相切，中心位于動物右耳前9 mm，在手術(shù)2 h后即進行第1次治療，刺激頻率為0.5 Hz，強度為70%最大輸出強度，連續(xù)刺激20次為1組，2組/d，至各時間點大鼠處死前1 d結(jié)束。結(jié)合組參數(shù)與療程分別同電針組和rTMS組。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 參照Bederson等［3］的評分方法，分別于7、14、28 d 3個時間點處死前觀察大鼠行為表現(xiàn)并進行神經(jīng)功能缺損評分。

1.2.4 切片制備 分各組大鼠分別于7、14、28 d 3個時間點處死前12 h內(nèi)每4 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg 1次，共3次，于最后1次注射后4 h用6%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射深度麻醉，行左心室升主動脈插管，剪開胸腔暴露心臟，剪開心包膜，用恒流泵經(jīng)過心臟灌注肝素化生理鹽水250 mL，灌注4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 M，pH 7.4)350 mL，之后立刻斷頭取腦，放入4℃的4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 M，pH 7.4)過夜，固定不超過24 h，于顳葉以梗死灶為中心冠狀切腦，包括梗死灶周圍皮質(zhì)、海馬、側(cè)腦室等，洗凈腦組織表面的固定液，隨后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，石蠟切片機連續(xù)冠狀位切片(片厚20 μm)，每隔5張取1張。每只大鼠隨機取3張連續(xù)切片，每部位各隨機取3個非重疊視野進行計數(shù)，采用HPIAS21000圖像分析軟件進行光密度半定量分析。

1.2.5 NeuN免疫組化 （1）冰凍切片從冰箱取出后經(jīng)-20℃冰箱回溫10 min，再經(jīng)-4℃冰箱4%多聚甲醛固定15 min；（2）滴加3%H2O2-甲醇20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；（3）經(jīng)枸櫞酸鹽 （pH 6.0）微波抗原修復(fù) （溫度95℃，15 min），滴加正常封閉血清，室溫1～2 h；（4）滴加小鼠抗NeuN(抗體效價1∶100)，4℃冰箱過夜；（5）滴加生物素化二抗和SA-HRP溶液1∶200，室溫1 h；（6）以上各步驟間都用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)漂洗3次每次5 min，鏡下DAB-H2O2適度顯色，顯色后常規(guī)脫水，透明，封片；（7）替代實驗：陰性對照采用PBS代替一抗。結(jié)果判定:NeuN的表達以細胞核為主，少數(shù)表達在胞漿。

1.2.6 NeuN/BrdU標記細胞免疫熒光照相 （1）BrdU陽性細胞的免疫熒光標記：①在65℃下用50%甲酞胺和檸檬酸鈉溶液孵育腦切片 2 h；②PBS洗 5 min×3次，4 mol/L鹽酸室溫孵育30 min；③PBS洗5 min×3次，0.1 mol/L硼酸溶液室溫孵育20 min，行DNA變性；④PBS洗5 min×3次后，含有0.1%Triton-X100的10%小牛血清封閉孵育2 h；⑤甩去封閉液加BrdU單克隆抗體(1∶200)4℃過夜；⑥PBS洗5 min×3次后加相應(yīng)熒光二抗(Cy3標記驢抗兔)，孵育1 h；⑦PBS洗5 min×3次后50%甘油封片，熒光顯微鏡下照相。（2）BrdU/NeuN標記細胞：①切片按上述BrdU標記方法行酸變性及核變性后；②PBS洗5 min×3次后，用含有0.1%Triton-X100的10%小牛血清孵育2 h；③封閉液加BrdU（1∶200）/NeuN（1∶100）抗體4℃過夜；④洗5 min×3次后加相應(yīng)熒光二抗，孵育1 h；⑤PBS洗5 min×3次后50%甘油封片，熒光顯微鏡下照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電針結(jié)合rTMS對大鼠缺血后神經(jīng)行為學(xué)評分的影響

Bederson神經(jīng)功能評定正常組得分均為0，電針組、rTMS組、結(jié)合組與模型組在7、14、28 d相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)合組與電針組、rTMS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 對各組大鼠不同時間段缺血后神經(jīng)功能缺損評分比較 （n=8，±s，分）

表1 對各組大鼠不同時間段缺血后神經(jīng)功能缺損評分比較 （n=8，±s，分）

注：與模型組比較★★P＜0.05；與電針、rTMS組比較▲▲P＜0.05。

組別正常組模型組電針組rTMS組結(jié)合組7 d 0 2.75±0.46 2.00±0.53★★2.00±0.53★★1.36±0.52★★▲▲14 d 0 2.50±0.53 1.75±0.46★★1.63±0.52★★1.00±0.53★★▲▲28 d 0 1.63±0.52 0.88±0.35★★1.00±0.53★★0.25±0.46★★▲▲

2.2 電針結(jié)合rTMS對大鼠海馬NeuN陽性表達的影響

NeuN正常組僅有少量稀疏表達，染色淡；海馬顆粒下區(qū)（SGZ）和側(cè)腦室下區(qū)（SVG）缺血后7 d即有NeuN陽性細胞的表達明顯增加，14 d表達明顯達到高峰，28 d表達開始下降；NeuN/BrdU標記細胞數(shù)在正常組幾乎沒有表達，缺血后7 d表達增加，14 d表達達到高峰，28 d表達下降，仍高于正常組。增加最明顯的為結(jié)合組，電針組和rTMS組也有明顯增加，但電針組和rTMS組之間無顯著性差異，模型組增加最少；從組間比較看，電針組、rTMS組、結(jié)合組與模型組在7、14 d時差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，結(jié)合組在7、14 d時均高于電針組和rTMS組(P＜0.05)，電針組、rTMS組、結(jié)合組與模型組在28 d相比NeuN及NeuN/BrdU陽性細胞數(shù)目均無顯著性差異。結(jié)果見表2～3。

表2 對各組大鼠缺血后不同時間SGZ和SVZ NeuN陽性細胞數(shù)量比較 （n＝4，細胞數(shù)/mm2，±s）

表2 對各組大鼠缺血后不同時間SGZ和SVZ NeuN陽性細胞數(shù)量比較 （n＝4，細胞數(shù)/mm2，±s）

注:與模型組比較☆P＜0.05；與電針組、rTMS組比較△P＜0.05。

SGZ SVZ組別正常組模型組電針組rTMS組結(jié)合組7 d 19.32±6.86 50.25±13.26 100.59±13.98 95.87±15.32☆132.18±16.29☆△14 d 18.25±6.73 86.02±15.36 156.28±14.15 155.67±15.22☆207.91±15.62☆△28 d 17.07±6.71 32.92±13.71 36.29±13.75 33.72±14.19 36.52±15.22 7 d 11.32±5.56 43.26±12.25 93.95±14.89☆87.32±13.87☆105.28±15.18☆△14 d 12.37±5.31 71.36±13.02 147.15±15.28☆139.22±16.68☆193.62±16.91☆△28 d 11.53±5.22 25.91±13.29 30.75±11.16 27.17±12.72 32.55±13.07

表3 對各組大鼠缺血后不同時間SGZ和SVZ NeuN/Brdu陽性細胞數(shù)量比較 （細胞數(shù)/mm2，n＝4，±s）

表3 對各組大鼠缺血后不同時間SGZ和SVZ NeuN/Brdu陽性細胞數(shù)量比較 （細胞數(shù)/mm2，n＝4，±s）

注:與模型組比較☆P＜0.05；與電針組、rTMS組比較△P＜0.05。

SGZ SVZ組別正常組模型組電針組rTMS組結(jié)合組7 d 13.16±6.22 25.26±14.56 38.27±14.87☆35.39±15.12☆102.16±16.07☆△14 d 13.15±6.13 36.32±15.59 77.68±15.35☆72.51±16.02☆157.11±17.29☆△28 d 12.51±6.29 27.93±13.67 33.69±14.45 29.12±13.76 35.02±15.37 7 d 8.65±3.03 35.65±12.95 71.78±13.07☆69.91±11.21☆86.01±15.71☆△14 d 3.32±3.21 51.59±13.32 115.35±15.73☆111.07±15.95☆156.22±16.77☆△28 d 3.91±3.05 17.67±11.03 21.54±12.01 19.67±11.37 27.25±12.07

3 討論

成年腦內(nèi)的NSCs處于相對靜止狀態(tài)，當(dāng)環(huán)境因素的強度達到引起其增殖的閾值時，NSCs才開始進行自我復(fù)制，同時新產(chǎn)生的神經(jīng)細胞遵循一定的規(guī)律進行遷移，到達指定的位置后，按所處環(huán)境因素的決定分化成相應(yīng)區(qū)域的神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞或神經(jīng)系統(tǒng)的其他功能細胞，以替代由損傷等原因引起的神經(jīng)細胞缺失并重建神經(jīng)功能[5]。為了解大鼠腦梗死治療前后細胞增殖情況，我們采用免疫組化方法對BrdU的陽性表達進行了檢測。結(jié)果觀察到無論電跳臺實驗還是BrdU免疫組化結(jié)果均顯示電針結(jié)合rTMS組均優(yōu)于單純的電針組或rTMS組，證實電針結(jié)合rTMS能更有效地促進大鼠NSCs的增殖，兩者具有相互促進的作用。

NeuN為神經(jīng)元的特異性標志物，為胞核表達。在本實驗中，缺血后7 dNeuN和NeuN/BrdU陽性細胞的表達明顯增加，14 d表達達到高峰，28 d表達開始下降，但仍高于正常組。增加最明顯的為電針結(jié)合rTMS組，電針組和rTMS組也有明顯增加，模型組增加最少；從組間比較看，電針組、rTMS組、電針結(jié)合rTMS組與模型組在7、14 d時有顯著性差異，電針結(jié)合rTMS組在7、14 d時均高于電針組和rTMS組，與Iwai等[6]的研究結(jié)果相比可見，電針結(jié)合rTMS干預(yù)后，NSCs的分化有不同程度的提前。

綜上所述，缺血損傷后不同腦區(qū)出現(xiàn)了神經(jīng)前體細胞增殖，隨病程延長逐漸向成熟細胞過渡，最終分化為成熟的神經(jīng)元。電針結(jié)合rTMS激活內(nèi)源性NSC或神經(jīng)先祖細胞的增殖、分化及整合，促進了神經(jīng)再生及損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。但其對NSCs分化的作用機制有待進一步研究。

[1]彭 力，黃曉琳，韓肖華，等.電針結(jié)合經(jīng)顱磁刺激對腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞增殖和電跳臺的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2008，17(2): 206-208.

[2]廖維靖，劉淑紅，范 明，等.線栓阻斷大鼠大腦中動脈制作缺血性腦損傷模型的改良[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2002，24(6): 345-349.

[3]Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17(3):472-476.

[4]鄧春雷，殷克敬.實驗針灸學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:143.

[5]Gage F H.Maminalian neural stemcells[J].Science，2000（287）：1 433-1 438.

[6]Iwai M，Sato K，Omopi M，et al.Three steps of neural stem cells development in the gerbil dentate gyrus after transient isehemia[J].J Cereb Blood Flow Metab，2002，22:411-419.