柳 明,喻達輝黃桂菊

(1.農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖生態(tài)與質(zhì)量控制重點開放實驗室,中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州510300; 2.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院,上海 201306)

大珠母貝(Pinctada maxima),俗稱白蝶貝,屬于軟體動物門雙殼綱異柱目珍珠貝科珠母貝屬(Pinctada)。主要分布于熱帶海域,如澳大利亞、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等地[1]。大珠母貝經(jīng)濟價值很高,其肉(閉殼肌)質(zhì)味道鮮美、營養(yǎng)豐富,堪稱為宴席佳品。它的殼形獨特,珍珠層厚而有美麗光澤,是名貴的工藝原料。用大珠母貝養(yǎng)殖出來的珍珠顆粒大,色澤好,價格高,既是貴重的裝飾品,又是名貴藥材。我國的大珠母貝資源本來就很少,屬于國家二級保護動物,過度利用使其更處于瀕危狀態(tài),因此不能直接用野生大珠母貝進行育珠生產(chǎn)而必須使用人工繁殖個體。人工養(yǎng)殖貝育成的珍珠一致性和質(zhì)量都較高。然而大珠母貝的海區(qū)養(yǎng)殖一直難以成功,幼貝出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象,導致其珍珠養(yǎng)殖不能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。其原因除了養(yǎng)殖環(huán)境惡化外,種質(zhì)資源的衰退也是重要原因之一。因此開展遺傳選育,改良種質(zhì)是有效開發(fā)大珠母貝資源的重要途徑。在開發(fā)過程中,對選育群體進行遺傳多樣性分析和監(jiān)測是十分必要的。微衛(wèi)星DNA是遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種最適遺傳標記之一。但大珠母貝的微衛(wèi)星標記數(shù)量不多。Evans等[2]報道了6個多態(tài)標記和Smith等[3]報道了8個微衛(wèi)星標記,遠不能滿足應用的需要,因此必須開發(fā)大量的微衛(wèi)星標記。

本實驗采用生物素-磁珠富集法和探針雜交相結(jié)合的方法,構(gòu)建了大珠母貝的微衛(wèi)星富集文庫,篩選大珠母貝的微衛(wèi)星標記,為大珠母貝的遺傳育種、保護生物學和種群遺傳多樣性等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

用于微衛(wèi)星分離的大珠母貝樣品于2008年8月采集于海南三亞,用于微衛(wèi)星多態(tài)引物篩選的大珠母貝30個樣品個體于2007年7月采集于海南三亞養(yǎng)殖群體,取閉殼肌保存于95%酒精中。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

按照傳統(tǒng)的酚-氯仿法[4]提取基因組DNA,溶于100 μL滅菌雙蒸水中,-20℃保存待用。

1.2.2 基因組DNA酶切、接頭連接與PCR擴增

基因組DNA用內(nèi)切酶MseI酶切3 h,20 μL反應體系包括：10×NEB Buffer2 2 μL,100×BSA 0.2 μL,MseI (10 U/μL) 0.5 μL,20 mg/LDNA 模板 3 μL,ddH2O 14.3 μL。將酶切產(chǎn)物與雙鏈接頭(接頭A序列為：5′-TAC TCA GGA CTC AT-3′,接頭 B 序列為：5′-GAC GAT GAG TCC TGA G-3′) 于 16 ℃連接過夜,反應體系如下：10 mmol/L T4 DNA ligase緩沖液2 μL,50 mmol/L 接頭 1.8 μL,酶切產(chǎn)物 11 μL,400 U/μL 的T4 DNA ligase 0.2 μL。連接產(chǎn)物用簡并引物MseI-N[5′-GAT GAG TCC TGA GTA A(N)-3′]進行 PCR 擴增,PCR 反應總體積 20 μL,包括 10×PCR buffer 2.0 μL,10 mmol/L dNTPs 0.4 μL,50 mmol/LMseI-N 0.2 μL,1UTaq酶,10×連接產(chǎn)物 2 μL。反應程序如下：95 ℃預變性5 min,然后進行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：95℃變性30 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)數(shù)進行梯度篩選,分別做 14、17、20、23、26個循環(huán),以確定最佳循環(huán)數(shù),最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 探針雜交與磁珠富集

將雜交緩沖液70 μL、PCR產(chǎn)物25 μL和生物素標記的(CA)15探針(10 μmol/L)5 μL 混合,于 65 ℃雜交1 h。結(jié)束后,將磁珠加入到100 mL雜交液中,室溫溫浴 30 min,移去雜交液并保存。用 400 μL的TEN1000[5]于室溫下洗滌磁珠 3次,每次 5 min,保留第 3次的洗脫液。用 400 μL 的 0.2×SSC(含0.1%SDS)洗3次,每次5 min,保留第3次的洗脫液。用 400 μL TEN1000 再洗 5 min,保存洗脫液。加 100 μL TE重懸磁珠,100 ℃水浴10 min,將DNA從磁珠-探針-DNA混合物中分離,水浴結(jié)束后將離心管置于磁架上,吸出含有 DNA片段的洗脫液,然后立刻置于冰上。用100 μL TE再次重懸磁珠,保存洗脫液。以上述6管洗脫液為模板,用引物MseI-N進行PCR擴增,將 PCR擴增產(chǎn)物于 1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,檢測富集效果。富集效果好的樣品用 DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN)回收純化PCR產(chǎn)物,純化產(chǎn)物按常規(guī)方法與pMD20-T載體16 ℃連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng),構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫。

1.2.4 富集文庫的篩選、測序與引物設(shè)計

挑選單克隆,接種到含有氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h,菌液用載體通用引物和探針序列引物進行PCR篩選鑒定,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測,選取符合條件的候選克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司進行DNA測序。利用Clustal X[6]對序列特征進行分析,并用引物設(shè)計軟件primer 5.0對所得的微衛(wèi)星序列設(shè)計引物。

1.2.5 微衛(wèi)星多態(tài)引物的篩選

將引物稀釋成10 μmol/L,取海南三亞養(yǎng)殖群體共 30個個體,進行 PCR 擴增,體系如下：10×PCR buffer 2.0 μL,10 mmol/L dNTPs 0.4 μL,10 μmol/L正、反向引物各 0.5 μL,5 g/LTaq酶 0.2 μL,20 mg/L DNA模板2μL,ddH2O 14.4 μL。通過調(diào)整退火溫度,來獲得最佳PCR條件,將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳,EB染色,將有目的條帶出現(xiàn)的PCR產(chǎn)物再進行5%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠電泳,篩選具有多態(tài)性的引物。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計每個位點的等位基因數(shù)量(A),用 Pop-Gen1.32軟件[7]來計算群體的有效等位基因數(shù)(Ae)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)、Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)(D)以及卡方檢驗(PHW)。根據(jù)Botstein等[8]的公式計算每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性信息含量(CPI),計算公式如下：

式中fi和fj分別表示某一位點第i個和第j個等位基因在群體中的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星DNA的分離篩選

用內(nèi)切酶MseI對基因組 DNA進行酶切后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)酶切片段主要集中在200～1 000 bp,符合構(gòu)建基因組文庫的要求。通過探針雜交,磁珠吸附,清洗和洗脫,PCR擴增,載體連接和轉(zhuǎn)化等步驟,構(gòu)建了大珠母貝基因組微衛(wèi)星富集文庫,共獲得近 2 000個陽性克隆,隨機挑選1 200個克隆進行PCR檢測。選取具有穩(wěn)定擴增帶的陽性克隆298個進行測序,分析測序結(jié)果獲得了211個含有重復次數(shù)大于或等于6的微衛(wèi)星序列。211個序列共含有 251個微衛(wèi)星位點,一般每個克隆含有1～3個位點,其中1個克隆含有6個位點,微衛(wèi)星序列長度大小范圍為 101～787 bp。對所得微衛(wèi)星位點進行分類,發(fā)現(xiàn)(CA/GT)n微衛(wèi)星重復序列204個,占了絕大多數(shù),此外還發(fā)現(xiàn)了AG、AT、GC、TC、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、GACG等重復類型。根據(jù)Weber[9]提出的微衛(wèi)星序列分類標準,在所獲得的微衛(wèi)星位點中,完美型159個,占63%; 非完美型80個,占32%; 復合型12個,占5%。

2.2 微衛(wèi)星引物的篩選

根據(jù)包含微衛(wèi)星位點的序列,用引物設(shè)計軟件primer 5.0設(shè)計引物,共設(shè)計引物90對,隨機挑選了其中30對送去上海生物工程有限公司合成。通過優(yōu)化PCR反應條件,篩選出21對能夠穩(wěn)定擴增的引物。將有目的條帶出現(xiàn)的PCR產(chǎn)物再進行5%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠電泳,篩選出10對多態(tài)性引物(表1)。

表1 10對多態(tài)性微衛(wèi)星引物序列Tab.1 Sequences of ten pairs of polymorphic microsatellite primers

表2 10個微衛(wèi)星多態(tài)性位點的數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.2 The statistics of ten microsatellite loci

2.3 微衛(wèi)星位點多態(tài)性分析

使用PopGen1.32軟件對所得的微衛(wèi)星多態(tài)性位點進行數(shù)據(jù)分析,由表2可知,10個位點共獲得59個等位基因,其中M412位點檢測出的等位基因最多(8個),M393位點的等位基因最少(2個),大部分位點為5～7個,大小在133～444 bp之間,表現(xiàn)出高度多態(tài)性。有效等位基因數(shù)(Ae)為1.342 3～6.000 0,平均為4.124 0; 觀測雜合度(Ho)的范圍為 0.300 0～0.800 0,平均為 0.533 3; 期望雜合度(He)范圍為 0.259 3～0.847 5,平均為 0.717 9; 多態(tài)性信息含量(CPI)在0.222 5～0.811 8之間,平均為0.671 4。根據(jù)雜合度計算的遺傳偏離指數(shù)(D),發(fā)現(xiàn)除了M393和M781位點為正值外,其余各位點均表現(xiàn)為不同程度的雜合子缺失。根據(jù) Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(PHW),只有 M393、M781和 M1758位點處于平衡狀態(tài)(PHW＞0.05),其他位點都不同程度地偏離了平衡。

3 討論

磁珠富集法是一種簡單快速的篩選微衛(wèi)星的方法,通過帶有鏈霉親和素的磁珠親和捕捉生物素標記的微衛(wèi)星探針結(jié)合的DNA基因組片段,從而獲得高度富集微衛(wèi)星小插入片段的基因組文庫,且獲得的微衛(wèi)星重復序列的比例比小克隆的比例高[10],目前國內(nèi)外較多采用這種方法[11,12]。本實驗在所測298個克隆中有 211個含有微衛(wèi)星序列,陽性克隆率高達70.81%。姬長虹等[13]的報道為95.3%,李小寧等[14]為 88.5%,說明此法是一種高效快速的微衛(wèi)星標記分離方法。但貝類多態(tài)位點的篩選效率相對較低,需要設(shè)計大量的引物才能獲得為數(shù)不多的多態(tài)標記[15],本實驗合成的 30對引物中僅有10對擴增出具有多態(tài)性的目的條帶,曲妮妮等[16]在篩選合浦珠母貝微衛(wèi)星標記的研究中49對引物只有9對具有多態(tài)性。出現(xiàn)這類情況的原因可能與貝類個體之間的遺傳變異程度較大有關(guān)。Arias 等[17]對扇貝的 SNPs檢測,發(fā)現(xiàn)大約 100 個堿基就出現(xiàn) 1 次 SNP。Sauvage等[18]對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas) 的研究,發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)平均每60 bp 出現(xiàn)1 次SNPs,在非編碼區(qū)每40 bp 就出現(xiàn)1 次SNPs。這些高頻率的點突變?yōu)槲⑿l(wèi)星引物的擴增篩選帶來了很大困難。

在動物基因組中微衛(wèi)星大約 6～10 kb就出現(xiàn)一次[19],其中二堿基重復類型(CA/GT,AG/TC,AT/TA)的微衛(wèi)星最為常見[20,21]。本實驗采用了其中的(CA)15探針,在所得的 251個微衛(wèi)星位點中,含(CA/GT)n的有 204個,約占總數(shù)的 81%,其次是(AG/TC)n和(AT)n,各有24和6個,分別占總數(shù)的10%和2%。結(jié)果表明在大珠母貝中除了有大量的雙堿基序列外,還有其他三堿基、四堿基和四堿基以上的微衛(wèi)星序列,因此可以考慮采用其他類型的探針研究開發(fā)大珠母貝基因組微衛(wèi)星,以便獲得更多的微衛(wèi)星分子標記。

微衛(wèi)星核心序列突變率相對較高,造成了微衛(wèi)星核心序列重復次數(shù)的變化,這是微衛(wèi)星多態(tài)性的基礎(chǔ)[22]。Ellegren[23]認為真核生物中微衛(wèi)星重復堿基重復序列長度大多在30次重復以下,本實驗所得序列重復次數(shù)在8～25的有58%,與上述分析微衛(wèi)星的結(jié)論相似。關(guān)于微衛(wèi)星重復數(shù)與多態(tài)性的關(guān)系,多數(shù)學者認為微衛(wèi)星重復次數(shù)與多態(tài)性之間存在正相關(guān),Valdes[24]認為重復次數(shù)低于 5的微衛(wèi)星幾乎檢測不出多態(tài)性,一般微衛(wèi)星的核心序列重復次數(shù)越高,其等位基因數(shù)也就越多,即多態(tài)性也就越高[25]。但較長的(AT)n容易形成二級結(jié)構(gòu)而造成PCR效率下降,以及在電泳分離中造成較大誤差,并會給測序工作帶來一些麻煩[26]。本研究所得的大珠母貝微衛(wèi)星序列中,除去(AT)n重復單元以外,重復次數(shù)在 5次以上的約占94%。因此理論上講,設(shè)計的引物可以進行群體的遺傳多樣性研究

雜合度是度量群體變異的一個重要參數(shù)[27],包括觀測雜合度和期望雜合度。本實驗所獲得的10個微衛(wèi)星位點有 8個位點的觀測雜合度低于期望雜合度,其范圍相應地低于Smith等[3]報道的Ho(0.479～0.891)和He(0.872～0.972),與 Evans 等[2]報 道 的Ho(0.172～0.813)和He(0.163～0.878)比較接近,與谷龍春等[28]報道的Ho(0.167～0.833)相近,而略低于其He(0.658～0.915)。CPI值是等位基因頻率和數(shù)目變化的函數(shù),是衡量片段多態(tài)性的較好指標,能反映出某個遺傳標記所含的遺傳信息容量。根據(jù) Bostein等[8]提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標,當CPI＞0.5 時,該基因座為高度多態(tài)基因座;當 0.25 ＜CPI＜ 0.5 時,為中度多態(tài)基因座; 當CPI＜0.25 時,則為低度多態(tài)基因座。試驗中開發(fā)的10個微衛(wèi)星基因座除M393為低度多態(tài)性外,其他9個均為高度多態(tài)性,表明這些微衛(wèi)星位點適合大珠母貝的遺傳多樣性研究。結(jié)果為進一步開展大珠母貝的遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和遺傳選育等研究工作奠定了一定基礎(chǔ)。

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