李艷梅, 梁革梅, 趙奎軍*, 郭予元

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

近十年來(lái),現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,尤其是PCR的出現(xiàn),引起了DNA遺傳分析的一場(chǎng)巨大革命。以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋技術(shù)大大加快了人類研究遺傳多樣性的步伐,為不同來(lái)源和不同復(fù)雜程度基因組的分析提供了有力的工具。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)AFLP技術(shù)是由荷蘭Keygene公司的兩位科學(xué)家Zabeau和Vos于1992年創(chuàng)立的,于1993年獲歐洲專利局專利,該技術(shù)以 RAPD和RFLP技術(shù)為基礎(chǔ),用其長(zhǎng),棄其短,從而成為一種精確、有效的分子標(biāo)記方法。它的基本原理是首先利用可產(chǎn)生黏性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對(duì)象的基因組序列,產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的酶切片段。然后,將這些酶切片段與含有與其有共同黏性末端的人工接頭連接,形成模板。為達(dá)到選擇擴(kuò)增的目的,再按照模板序列,在引物中添加具有選擇性的核苷酸(1～3個(gè)),然后PCR擴(kuò)增,結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對(duì)的酶切片段被擴(kuò)增。最后擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無(wú)來(lái)檢出多態(tài)性,也可以通過(guò)自顯影技術(shù)或者熒光的方法來(lái)檢測(cè)。

AFLP標(biāo)記與其他標(biāo)記如 RAPD、RFLP、SSR(微衛(wèi)星)相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于其他技術(shù),在整個(gè)基因組水平上,AFLP技術(shù)不僅具有高重復(fù)性,高分辨率,高靈敏性[1],而且它能夠一次同時(shí)擴(kuò)增50～100條帶。另外,擴(kuò)增不需要預(yù)先知道序列信息[2]。因此,雖然該技術(shù)自創(chuàng)立開(kāi)始首先運(yùn)用于植物分子生物學(xué)的研究中,但因其具有上述優(yōu)點(diǎn),同時(shí)還易于標(biāo)準(zhǔn)化,很快被推廣到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,如遺傳圖譜的構(gòu)建,遺傳多樣性分析、基因或基因組區(qū)域特異性標(biāo)記的篩選和定位、細(xì)菌鑒定及疾病診斷和腫瘤研究等。近年來(lái)該技術(shù)又在酶切、擴(kuò)增體系、檢測(cè)和分析方法等方面不斷得到改進(jìn),更為廣泛地應(yīng)用于多種生物的不同研究領(lǐng)域。

近十年來(lái),AFLP技術(shù)受到了昆蟲(chóng)學(xué)研究人員的青睞,已在昆蟲(chóng)學(xué)多個(gè)研究領(lǐng)域得到了較為成功的應(yīng)用,主要用于生物多樣性、種群遺傳分析、連鎖圖譜構(gòu)建等方面。本文簡(jiǎn)要介紹了AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在有益昆蟲(chóng)、重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)、檢疫害蟲(chóng)等研究中的應(yīng)用,并對(duì)該技術(shù)在昆蟲(chóng)學(xué)研究中應(yīng)用的前景進(jìn)行了展望。

1 AFLP技術(shù)在有益昆蟲(chóng)中的應(yīng)用

1.1 種質(zhì)資源鑒定以及系統(tǒng)進(jìn)化研究

家蠶(Bombyx mori L.)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),作為分類學(xué)上的一個(gè)物種,從地理來(lái)源上分為中國(guó)系統(tǒng)、日本系統(tǒng)、歐洲系統(tǒng)和亞熱帶及熱帶系統(tǒng)等4大系統(tǒng),有500多個(gè)品種,其生態(tài)和經(jīng)濟(jì)性狀各具特征。研究家蠶不同地理品種分類、進(jìn)化、親緣關(guān)系和遺傳差異是家蠶種質(zhì)資源鑒定、保存和利用的依據(jù),也是品種培育和推廣的理論基礎(chǔ)。近年來(lái),DNA分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展為家蠶品種遺傳多樣性的評(píng)價(jià)提供了新的途徑。其中,AFLP分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性檢出能力強(qiáng)和結(jié)果穩(wěn)定可靠的特點(diǎn),非常適合品種多樣性檢測(cè)和品種鑒定。

魯成等[3]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)我國(guó)不同地區(qū)野桑蠶、家蠶和柞蠶進(jìn)行了系統(tǒng)學(xué)研究和品種遺傳多樣性研究,對(duì)33個(gè)具有代表性的家蠶不同地理品種,以及浙江、陜西、重慶、江蘇、湖北、湖南、遼寧等10個(gè)地區(qū)的野桑蠶和5個(gè)柞蠶品種進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析和分子系統(tǒng)學(xué)研究。

張金衛(wèi)等[4]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)浙江省生產(chǎn)上應(yīng)用的6個(gè)家蠶品種(包括正反交)進(jìn)行了DNA指紋分析,篩選出5對(duì)引物,在6個(gè)家蠶品種中擴(kuò)增出157條帶,其中有多態(tài)性帶54條,且這些條帶組合對(duì)特定品種的引物是穩(wěn)定的,試驗(yàn)具有重演性。建立的方法可準(zhǔn)確地將供試的6個(gè)家蠶品種全部區(qū)分開(kāi)來(lái)。初步建立起利用DNA指紋來(lái)進(jìn)行家蠶品種鑒別的模型,可為保護(hù)家蠶育種產(chǎn)權(quán),登錄新品種,以及鑒定和檢測(cè)蠶種的真實(shí)性和純度,仲裁蠶種糾紛等提供客觀、科學(xué)的技術(shù)依據(jù)。

1.2 遺傳圖譜的構(gòu)建與功能基因標(biāo)記定位

家蠶不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),也是生物學(xué)研究的極好材料。家蠶遺傳連鎖圖譜是基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際應(yīng)用的中間橋梁,是家蠶資源、育種及分子克隆等許多應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。研究人員利用AFLP標(biāo)記紛紛建立遺傳圖譜,并對(duì)重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了標(biāo)記定位。其中 Tan等[5]利用AFLP技術(shù)首次對(duì)家蠶BC1群體進(jìn)行了分子連鎖圖譜的構(gòu)建。用35組引物在家蠶品系782和od100的回交子代中得到了1248個(gè)分離位點(diǎn),其中545個(gè)在BC1群體中符合1∶1分離比,構(gòu)建的AFLP遺傳連鎖圖中含356個(gè)標(biāo)記,構(gòu)成30個(gè)連鎖群,每個(gè)連鎖群包含4～36個(gè)標(biāo)記,平均為11.9個(gè)標(biāo)記,每個(gè)連鎖群長(zhǎng)度為37.4～691 cM之間,總的遺傳圖距為6512 cM,標(biāo)記間的平均距離為18.2 cM。并對(duì)性染色體上的基因od進(jìn)行了定位。萬(wàn)春玲等[6]、朱玉芳等[7]也分別利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建了家蠶分子連鎖圖譜。

魯成等[8]利用AFLP技術(shù),對(duì)家蠶品系 C100和大造的回交一代BC1群體進(jìn)行了連鎖圖譜的構(gòu)建。構(gòu)建了一張含有408個(gè)標(biāo)記位點(diǎn),33個(gè)連鎖群,總圖距為3676.7 cM,平均圖距為111.4 cM 的連鎖圖譜,標(biāo)記間距離為0.0～119.9 cM,平均間距9.1 cM。并將綠繭基因Gc定位在該圖譜的第22連鎖群的L-P4T6-107與 L-P6T4-84之間。在此基礎(chǔ)上分析了影響家蠶的全繭量、繭層量、繭層率和蛹體重4個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTL。通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖分析共檢測(cè)到11個(gè)QT Ls,其中控制全繭量的QT Ls有2個(gè),分別定位在第6、19兩個(gè)連鎖群上;控制繭層量的QTLs有3個(gè),分別定位在第3、14、19連鎖群上;控制繭層率的QTLs有3個(gè),分別定位在第2、11、15連鎖群上;控制蛹體重的 QT Ls有3個(gè),分別定位在第2、14、19連鎖群上。

Sima等[9]以F2代91個(gè)個(gè)體作為作圖群體,為家蠶繭質(zhì)性狀的QTLs定位構(gòu)建了一張較高密度的AFLP分子連鎖圖譜。692個(gè)有效位點(diǎn)中的550個(gè)構(gòu)成了a和b亞群,其中a亞群21個(gè)連鎖群含233個(gè)標(biāo)記,b亞群為28個(gè)連鎖群含317個(gè)標(biāo)記。a、b亞群中各連鎖群上標(biāo)記數(shù)目變化范圍在4～43個(gè)和3～35個(gè),連鎖群總長(zhǎng)度為1868.10 cM 和2677.50 cM,連鎖群的長(zhǎng)度變化在22.3～424.3 cM和2.4～366.5 cM,標(biāo)記的平均圖距變化在3.39～17.43 cM和0.80～26.96 cM,位點(diǎn)間的平均距離為8.81 cM和9.26 cM。平均圖距小于10 cM的連鎖群有14個(gè)和18個(gè),大于10 cM小于20 cM的連鎖群有7個(gè)。連鎖群上位點(diǎn)平均數(shù)為11.1個(gè)和11.31個(gè),連鎖群的平均長(zhǎng)度為89.0 cM和95.6 cM。a,b亞群平均總長(zhǎng)為2272.8 cM,平均圖距9.06 cM。符合QTLs定位的基本要求,為后一步的QTL定位和分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection,MAS)模型的建立奠定基礎(chǔ)。

1.3 AFLP用于社會(huì)昆蟲(chóng)行為學(xué)研究

社會(huì)昆蟲(chóng)的行為可塑性代表著一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象,引起分子生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。蜜蜂成為分子生物學(xué)家在分子水平上研究昆蟲(chóng)社會(huì)行為的模式種[10]。AFLP分子標(biāo)記和微衛(wèi)星技術(shù)已被用于研究蜜蜂的保衛(wèi)行為和刺吮行為[11]。Ruppell等[12]研究了蜜蜂的授粉行為,驗(yàn)證了前人研究的3個(gè)QTL標(biāo)記和1個(gè)候選基因,同時(shí)采用2個(gè)相互回交的種群,每個(gè)種群利用400多個(gè)AFLP標(biāo)記,從而標(biāo)記出2個(gè)新的QT Ls。該研究結(jié)果表明了蜜蜂食料行為遺傳體系的復(fù)雜性,明確地支持了 pln1,pln 2,pln 3,Amf or這4個(gè)基因包括在蜜蜂食料行為規(guī)律中的假定,并且增加了某些新的值得以后進(jìn)一步研究的影響蜜蜂食料喜好行為的因子。

2 AFLP技術(shù)在重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)中的應(yīng)用

2.1 重要害蟲(chóng)基因標(biāo)記以及抗藥性研究

害蟲(chóng)抗藥性是日益緊迫的世界性問(wèn)題,對(duì)一種或多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的昆蟲(chóng)及螨類已經(jīng)超過(guò)440種。害蟲(chóng)的抗藥性問(wèn)題使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)蒙受了巨大的損失,因此,關(guān)于抗藥性的監(jiān)測(cè)、檢測(cè)、機(jī)理、評(píng)價(jià)、治理等越來(lái)越得到人們的普遍關(guān)注。進(jìn)入20世紀(jì)90年代,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在DNA分子水平上,快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)與抗藥性有關(guān)的基因突變成為可能,越來(lái)越多的抗性相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)、測(cè)序及克隆,使人們能夠在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的水平上進(jìn)一步了解害蟲(chóng)的抗藥性機(jī)制,這將對(duì)了解害蟲(chóng)的抗性機(jī)制起到極大的推進(jìn)作用。隨著研究的進(jìn)一步深入,必將很大程度上增加人們對(duì)害蟲(chóng)抗藥性的預(yù)測(cè)和預(yù)防能力。

AFLP技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的多位點(diǎn)指紋技術(shù)[13],具有穩(wěn)定性好和多態(tài)率高等特點(diǎn),已經(jīng)被成功地應(yīng)用于多種害蟲(chóng)基因的標(biāo)記[14-15]。由于該技術(shù)能檢測(cè)出較為豐富的多態(tài)性信息,因此在昆蟲(chóng)學(xué)研究中,通常應(yīng)用于重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的遺傳作圖,以便定位或發(fā)現(xiàn)一些與抗藥性相關(guān)的基因[16-18]。小菜蛾作為一種世界性的蔬菜害蟲(chóng),對(duì)多種農(nóng)藥都產(chǎn)生了不同程度的抗藥性,并且它是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)在田間對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的害蟲(chóng)[19]。Heckle等[20]將AFLP分子標(biāo)記方法用于小菜蛾對(duì)Bt毒素的抗性遺傳研究,以抗性親本和敏感親本回交的后代為作圖群體,構(gòu)建了含有207個(gè)AFLP標(biāo)記,31個(gè)連鎖群的小菜蛾抗性遺傳圖譜,利用鱗翅目遺傳連鎖的雙相特征,將抗性基因BtR-1定位在第7連鎖群上,Heckel所提供的這個(gè)有力的工具促進(jìn)了對(duì)Bt抗性的了解、檢測(cè)以及治理研究,為研究人員開(kāi)展鱗翅目害蟲(chóng)抗性機(jī)理研究提供了參照。

自從1996年轉(zhuǎn)Bt基因棉花在我國(guó)推廣種植以來(lái),棉花上的主要害蟲(chóng)—棉鈴蟲(chóng)的危害得到了有效的控制,雖然到目前為止還未發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)在田間對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性,但是梁革梅等[21]報(bào)道,通過(guò)室內(nèi)篩選可以獲得棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt殺蟲(chóng)劑、Bt毒蛋白和轉(zhuǎn)Bt基因棉的抗性種群。隨著轉(zhuǎn)基因植物在世界各地種植面積的日益增長(zhǎng),深入研究昆蟲(chóng)對(duì)Bt的抗性機(jī)制,對(duì)于運(yùn)用Bt制劑和Bt作物進(jìn)行害蟲(chóng)綜合治理以及延長(zhǎng)轉(zhuǎn)Bt基因作物的使用壽命尤為重要。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉蟲(chóng)組經(jīng)過(guò)多年的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)篩選獲得了對(duì)Bt毒素和Bt殺蟲(chóng)劑具有高抗性的棉鈴蟲(chóng)種群,在此基礎(chǔ)上,2007年張少平等以2971倍抗性品系BtR棉鈴蟲(chóng)(室內(nèi)用BtCry1Ac原毒素篩選75代)及敏感品系96S棉鈴蟲(chóng)為材料,運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)篩選其差異表達(dá)基因,共得到201個(gè)cDNA差異片段,37個(gè)與已知功能基因表達(dá)了同源性,包括氨肽酶N、鈣粘蛋白、堿性磷酸酶等,以及一些可能是棉鈴蟲(chóng)抗Bt有關(guān)的新受體和蛋白酶[22]。2008年李艷梅等參照Heckel的方法,以高抗品系BtR及敏感品系96S回交的后代為作圖群體,進(jìn)一步利用AFLP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了一張含有49個(gè)AFLP標(biāo)記,13個(gè)連鎖群的棉鈴蟲(chóng)基因組抗性遺傳圖譜,將抗性基因BtR-gene定位在第4連鎖群上(文章正在整理之中),這將為制定棉鈴蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉的抗性治理方案,延長(zhǎng)Bt棉的使用壽命、促進(jìn)我國(guó)棉鈴蟲(chóng)綜合治理和棉花生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

2.2 害蟲(chóng)近緣種的鑒定以及遺傳分化

DNA分子標(biāo)記適合鑒定形態(tài)上具有姊妹種特征昆蟲(chóng)的遺傳差異[23-25]。近年來(lái),AFLP技術(shù)已經(jīng)被用于近緣種的鑒定以及遺傳分化的研究[26-27]。

棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)在中國(guó)是同域分布、形態(tài)相似的兩個(gè)煙夜蛾屬近緣種害蟲(chóng)。在卵、幼蟲(chóng)、蛹期,甚至在成蟲(chóng)期通過(guò)外部形態(tài)特征區(qū)分它們都很困難也不可靠。Ming等[28]利用AFLP分子標(biāo)記來(lái)研究棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)這兩個(gè)近緣種實(shí)驗(yàn)室種群的種間和種內(nèi)遺傳距離和遺傳分化。結(jié)果表明,在利用9個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增的總共1963個(gè)AFLP分子標(biāo)記中,777個(gè)(39.6%)是棉鈴蟲(chóng)種特異性標(biāo)記,602個(gè)(30.7%)是煙青蟲(chóng)種特異性標(biāo)記,584個(gè)(29.7%)是2個(gè)近緣種的共有標(biāo)記;棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)平均每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增的DNA多態(tài)性片段數(shù)差異不顯著(p＞0.05),但棉鈴蟲(chóng)平均每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增的種特異性標(biāo)記數(shù)卻顯著多于煙青蟲(chóng)(p＜0.05);棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)的種內(nèi)遺傳距離分別為0.1230和0.1107,其種間遺傳距離為0.1783;聚類分析表明AFLP分子標(biāo)記完全能區(qū)分棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng);另外,還通過(guò)計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率和預(yù)期平均雜合度估計(jì)了棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室群體的遺傳多樣性。本研究表明,AFLP是用來(lái)研究棉鈴蟲(chóng)和煙青蟲(chóng)兩個(gè)近緣種害蟲(chóng)遺傳分化和遺傳關(guān)系的可靠方法和技術(shù),它能用來(lái)進(jìn)行種的鑒定、分化性狀基因的定位和克隆。

2.3 AFLP用于害蟲(chóng)種群基因流動(dòng)研究

利用分子標(biāo)記技術(shù)研究害蟲(chóng)種群之間是否發(fā)生基因流動(dòng)對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治工作具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。對(duì)害蟲(chóng)種群遺傳學(xué)知道得越多,就越能更好地回答所使用的防治方法是對(duì)整個(gè)種群都有作用還是只對(duì)種群的一小部分起作用的問(wèn)題。AFLP分子標(biāo)記數(shù)據(jù)衡量的昆蟲(chóng)種內(nèi)或種間的基因流動(dòng)和遺傳變異對(duì)明確闡述種群結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)是至關(guān)重要的[29-33]。

草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是西半球一些國(guó)家玉米上重要的經(jīng)濟(jì)害蟲(chóng),具有遷飛習(xí)性。Clark等[34]采用AFLP標(biāo)記技術(shù)研究了較廣地理范圍內(nèi)草地貪夜蛾的遺傳變異水平。試驗(yàn)種群分別為玉米上20個(gè)種群,毛泡桐樹(shù)上1個(gè)種群,檸檬樹(shù)上1個(gè)種群,狗牙根草上1個(gè)種群,共23個(gè)種群。采集地為墨西哥、美洲大陸、波多黎各、巴西以及阿根廷5個(gè)地區(qū)。AFLP結(jié)果表明大部分遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi)部而非種群之間,這說(shuō)明種群之間存在微效基因流動(dòng),進(jìn)而闡明西半球國(guó)家的草地貪夜蛾是雜種繁殖種群。

3 AFLP技術(shù)在檢疫害蟲(chóng)中的應(yīng)用

由于AFLP技術(shù)信息含量大,多態(tài)性豐富,所以能夠?yàn)榉诸悓W(xué)家提供準(zhǔn)確的、分子水平的分類依據(jù),解決了形態(tài)分類所不能解決的問(wèn)題。利用AFLP等分子標(biāo)記方法對(duì)檢疫性害蟲(chóng)的DNA信息進(jìn)行鑒定,具有準(zhǔn)確、客觀的特點(diǎn),鑒定周期短,對(duì)截獲的早期昆蟲(chóng)如卵、幼蟲(chóng)、蛹,不具有明顯形態(tài)特征時(shí),無(wú)需將昆蟲(chóng)培養(yǎng)至成蟲(chóng),即可直接提取其DNA用于鑒定。從而大大縮短鑒定周期,提高通關(guān)速度和檢驗(yàn)檢疫的效率。

地中海實(shí)蠅(Ceratitis capitata)為重要檢疫性害蟲(chóng)。Corsini等[35]采用AFLP技術(shù)分析了智利不同地區(qū)地中海實(shí)蠅的遺傳多樣性,并且克隆了3個(gè)片段,結(jié)果表明,其均可以作為鑒別地中海實(shí)蠅與Ceratitis屬其他種類以及果蠅屬(Drosophila)昆蟲(chóng)的分子探針。Kakouli-Duarte等[26]應(yīng)用AFLP技術(shù)成功地對(duì)實(shí)蠅科的地中海實(shí)蠅和納塔爾小條實(shí)蠅進(jìn)行了分離和鑒定。

4 AFLP應(yīng)用前景

AFLP分子標(biāo)記在昆蟲(chóng)學(xué)研究中最吸引人的應(yīng)用可能是在昆蟲(chóng)-植物交互作用方面。分子標(biāo)記在靶標(biāo)和定位重要抗蟲(chóng)植物的抗蟲(chóng)基因方面具有非常好的功效,同時(shí)在定位與作物相互作用的昆蟲(chóng)無(wú)毒基因方面也非常有價(jià)值[36]。

標(biāo)記數(shù)據(jù)產(chǎn)生的分子遺傳信息被用來(lái)描述害蟲(chóng)侵害特定植物種類的表型能力特征。這方面應(yīng)用的例子是水稻和小麥上的重要害蟲(chóng)癭蚊,稻癭蚊(Orseolia oryzae Wood-Mason),是亞洲南部以及東南部水稻上的主要害蟲(chóng),由于種群出現(xiàn)不同的生物型,克服了寄主植物的抗性基因,每年造成約5億美元的損失。類似地,小麥癭蚊(Mayetiola destructor Say)在小麥上也造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在北美洲,盡管小麥育種領(lǐng)域已經(jīng)開(kāi)發(fā)了32個(gè)抗性基因以防治小麥癭蚊,但是與小麥抗性基因相對(duì)抗的不同的有毒癭蚊種已經(jīng)進(jìn)化,導(dǎo)致小麥作物每年平均損失約1億美元。當(dāng)前還沒(méi)有合適的化學(xué)以及物理防治法來(lái)防治這類害蟲(chóng),在這種情況下,研究人員采取的策略是使用分子遺傳工具,弄清楚昆蟲(chóng)與寄主植物之間的相互作用。這有助于鑒定互作中的特定基因,開(kāi)發(fā)出抗性基因,應(yīng)用到抗蟲(chóng)植物開(kāi)發(fā)中,以發(fā)展抗蟲(chóng)植物治理策略。

Behura等[37]采用AFLP分子標(biāo)記,利用BSA(bulked segregant analysis)方法探索出一個(gè)AFLP標(biāo)記,這個(gè)標(biāo)記與和水稻抗性基因Gm2相互作用的稻癭蚊 vGm2無(wú)毒基因相連鎖。類似地,利用RAPD和AFLP技術(shù)結(jié)合BSA分析方法,還鑒定出幾個(gè)重要的小麥癭蚊無(wú)毒基因,這些基因與美國(guó)種植的小麥品種的抗性緊密相關(guān)[15,38-40]。這些研究工作有力地說(shuō)明了AFLP分子標(biāo)記方法有助于更好地了解害蟲(chóng)與寄主植物遺傳交互作用機(jī)制理論以及進(jìn)化基礎(chǔ)。

5 展望

AFLP技術(shù)自20世紀(jì)90年代發(fā)明以來(lái)引起了研究人員極大的興趣,它在種群遺傳學(xué),生態(tài)學(xué)以及進(jìn)化學(xué)研究中成為一個(gè)非常重要的分子標(biāo)記系統(tǒng)。近十年來(lái),AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在有益昆蟲(chóng)、重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)以及檢疫害蟲(chóng)等昆蟲(chóng)學(xué)研究領(lǐng)域已得到應(yīng)用。然而,這項(xiàng)技術(shù)在昆蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用還處于初步階段。由于AFLP標(biāo)記通常是作為顯性標(biāo)記,因此,它很難區(qū)分雜合子和純合子,所以除了盡快建立起該技術(shù)在昆蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用平臺(tái),對(duì)該技術(shù)進(jìn)行不斷地完善,減少人為誤差之外,更應(yīng)該深入學(xué)習(xí)AFLP數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法,使其能夠更加真實(shí)地反映基因組遺傳信息,可能的話,可以結(jié)合多種分子標(biāo)記方法,以期達(dá)到在分子水平上更好地了解昆蟲(chóng)的遺傳、進(jìn)化等方面信息的目的。

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