姚四新,宋東亮,王憲文,劉金華,劉興友

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀100193;2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;3.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南周口466000)

隨機(jī)引物PCR技術(shù)(random amplified polymorphic DNA,RAPD;arbitrarily primed PCR,APPCR)是由Welsh、Williams于1990年幾乎同時(shí)建立起來(lái)的一項(xiàng)DNA多態(tài)檢測(cè)技術(shù) 。該技術(shù)以PCR為基礎(chǔ),利用一系列單一的人工合成的隨機(jī)寡核苷酸鏈為引物,對(duì)所研究的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在該技術(shù)問(wèn)世的短短幾年內(nèi),因其獨(dú)特的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方式以及簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)而迅速滲透到分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的各個(gè)方面。隨后這一技術(shù)在物種鑒定、動(dòng)植物分類(lèi)、群體遺傳學(xué)調(diào)查、人類(lèi)腫瘤相關(guān)基因的分析、遺傳性突變基因的篩查、法醫(yī)學(xué)個(gè)體認(rèn)定及親權(quán)鑒定、新病毒發(fā)現(xiàn)等方面得到廣泛的應(yīng)用。

1 隨機(jī)引物PCR的基本原理

隨機(jī)引物(random primer或non-specific primer)是指使用非特異序列的寡聚核苷酸(通常長(zhǎng)度為10個(gè)堿基)作DNA合成過(guò)程中的引物,它與一般常用引物的區(qū)別在于其隨機(jī)性或是與特異性相對(duì)的概念,包括兩方面的含義:(1)核苷酸的排列順序是隨機(jī)的。(2)所有引物的的序列無(wú)直接相關(guān)性[1]。

隨機(jī)引物PCR基本原理與標(biāo)準(zhǔn)PCR基本一致,均為引物指導(dǎo)下的DNA擴(kuò)增,擴(kuò)增循環(huán)仍保持變性、退火、延伸三溫循環(huán)系統(tǒng)。引物為較短(5～10個(gè)堿基)的隨機(jī)DNA片段(即隨機(jī)引物),其產(chǎn)物是整個(gè)基因組DNA內(nèi)與隨機(jī)引物配對(duì)的多個(gè)重復(fù)序列間的DNA片段,而不是兩個(gè)特異引物所限定的特異靶基因片段。擴(kuò)增從模板DNA分子變性解鏈開(kāi)始,隨著溫度的降低,引物掃描整個(gè)DNA模板分子尋找退火位點(diǎn)并與之結(jié)合。此后在DNA聚合酶(Taq酶)作用下引物延伸,產(chǎn)生“第一循環(huán)”擴(kuò)增產(chǎn)物。在以后的擴(kuò)增循環(huán)中,僅有第一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物能得到有效擴(kuò)增,且擴(kuò)增產(chǎn)物在經(jīng)歷一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)過(guò)程后逐漸減弱,進(jìn)入平臺(tái)期。

在較低的退火溫度下,用適當(dāng)?shù)囊幌盗袎A基排列順序不同的寡聚核苷酸單鏈DNA(通常長(zhǎng)度為10個(gè)堿基,10聚體分子)為引物,以序列不明的基因組DNA或 RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,錯(cuò)配是不可避免的,但不能發(fā)生在引物3′端的5～6個(gè)堿基內(nèi)。理論上,并不一定要求整個(gè)引物都與模板復(fù)性,而只要引物的一部分特別是3′端有3～4個(gè)以上堿基與模板互補(bǔ)復(fù)性即可使引物延伸。

2 隨機(jī)引物PCR的特點(diǎn)

2.1 隨機(jī)引物 PCR的優(yōu)點(diǎn) 隨機(jī)引物PCR不僅克服了同工酶位點(diǎn)偏少的缺點(diǎn),避免了RFLP操作技術(shù)復(fù)雜的弊端無(wú)需制備克隆,同位素標(biāo)記,Southern印記分子雜交,使其在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的分子標(biāo)記成為可能,而且能檢測(cè)每個(gè)基因位點(diǎn),多態(tài)性含量豐富,變化范圍大0.2～0.9;另外,對(duì)模板DNA的純度要求不高且多態(tài)性檢出率高,試驗(yàn)成本低。

2.2 隨機(jī)引物PCR的局限性 隨機(jī)引物PCR技術(shù)所受影響因素比較多,主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:2.2.1 模板DNA的質(zhì)量 隨機(jī)引物PCR試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性是大家普遍關(guān)心的問(wèn)題,這類(lèi)問(wèn)題的主要原因是由于模板DNA的質(zhì)量不合格引起的。檢查模板DNA的質(zhì)量是否合格的簡(jiǎn)單方法是在200 ng～200 pg這一范圍內(nèi)對(duì)DNA作一系列的1/2稀釋,如果一定濃度的DNA用不同的引物均不能產(chǎn)生可靠的指紋,那么模板的質(zhì)量就值得懷疑了。解決這一問(wèn)題的方法是制備較高質(zhì)量的模板,避免污染非靶DNA序列,選擇合適的模板DNA濃度,每種樣品試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)至少要用兩種濃度的DNA模板進(jìn)行分析[2]。

2.2.2 引物的選擇 隨機(jī)引物可用于所有物種,但對(duì)某些特定的研究對(duì)象要獲得DNA多態(tài)性仍需進(jìn)行引物篩選和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化;并非所有的隨機(jī)引物均能擴(kuò)增出有意義的結(jié)果,所以應(yīng)進(jìn)行多個(gè)引物的嘗試。

2.2.3 PCR反應(yīng)條件 結(jié)果的重復(fù)性與試驗(yàn)條件密切相關(guān),不同實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果可能缺乏可比性;另外同一實(shí)驗(yàn)室因其選擇的引物不同,反應(yīng)控制的條件如Mg濃度,模板濃度不同,所得指紋圖譜亦不相同。所以要求在運(yùn)用這一技術(shù)時(shí)盡量考慮到對(duì)引物的選擇及不同批次試驗(yàn)條件的一致,同時(shí)應(yīng)將研究的重點(diǎn)放在同一條件下所得結(jié)果的解釋。

2.3 隨機(jī)引物的設(shè)計(jì) 因?yàn)殡S機(jī)引物PCR不需要特異引物,選擇引物時(shí)亦不能按已知 DNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)合成,所以任何引物均可用rPCR方法擴(kuò)增出rPCR指紋圖,關(guān)于引物的堿基數(shù)目,從理論上講,引物越短,造成與模板錯(cuò)配的機(jī)會(huì)越多,因而顯示的指紋圖條帶越多,一般常用的長(zhǎng)度為 8～10 bp,有的可達(dá)20 bp左右。

3 隨機(jī)PCR技術(shù)的應(yīng)用

近年來(lái),對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的病毒性傳染病大多來(lái)自于動(dòng)物,其中的大多數(shù)致病因子如艾滋病病毒、流感病毒、SARS病毒等均為 RNA病毒。而目前病毒變異的日益多樣性迫切需要人們?nèi)ケO(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)其動(dòng)態(tài)的變化,這就需要一種快速靈活的方法來(lái)檢測(cè)病毒的全基因序列。

有兩種策略應(yīng)用PCR方法可以擴(kuò)增出事先完全缺乏準(zhǔn)確的基因信息的基因序列,即代表性差異分析法(representational difference analysis,RDA)和核酸序列非依賴性基因擴(kuò)大法(sequence independent single primer amplification,SISPA)。第一種策略依賴于所選擇的隨機(jī)引物與多量cDNAs或基因組DNA在PCR變性過(guò)程中的結(jié)合,擴(kuò)增產(chǎn)物的大小在50～600 bp左右。

SISPA技術(shù)由Reyes G R和Kim J P[3]于1991年建立,其方法需要在DNA模板鈍末端連接一非對(duì)稱(chēng)引物,經(jīng)過(guò)若干循環(huán)的變性、退火和延伸后,模板的數(shù)量得到擴(kuò)增,后經(jīng)克隆、測(cè)序、分析得到基因序列。Allander T、Zhang T等人采用 SISPA技術(shù)[4-6]測(cè)定了未知DNA及RNA病毒的序列,研究證實(shí)應(yīng)用這一方法對(duì)于不同類(lèi)型和來(lái)源的病毒均有效果,所獲得的病毒全基因序列大小從3 000 bp～15 kb不等。對(duì)于病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物、尿囊液及糞便等材料經(jīng)適當(dāng)處理采用SISPA技術(shù)在宿主染色體污染的前提下均獲得了病毒的全基因序列。不幸的是,應(yīng)用該技術(shù)從人的血漿或血清中直接發(fā)現(xiàn)或鑒定新病毒方面還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有很大的實(shí)用性,因?yàn)閬?lái)自宿主的染色體DNA相對(duì)含量較高。

Allander T 、Breitbart M 、Jones M S 、van der Hoek L等人應(yīng)用DNase核酸序列非依賴性基因擴(kuò)大法(DNase-SISPA)從臨床樣品中鑒定出牛和人的新病毒[4-5,7-9]。

Djikeng A等人(2008)[10]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了新的改進(jìn),將RNase酶處理加入到SISPA技術(shù)的程序中,以清除外源RNA的污染如核糖體 RNAs。針對(duì)polyA尾的病毒,在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中采用隨機(jī)引物的結(jié)合物(FR26RV-N::5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TCN NNN NN-3′)以及連接 poly T 的 引物(FR40RV-T:5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TC T TT T TT T TT T TT T T T T T T TT-3′)以增加3′端的覆蓋率。為了捕獲病毒核酸的5′端,在Klenow 反應(yīng)過(guò)程中,采用六聚體隨機(jī)引物連接一保守序列即病毒特異性引物(如:鼻病毒):5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TC T TA AAA CTG G-3′,由此大大提高了試驗(yàn)的成功率。

以上RAP-PCR和SISPA技術(shù)在測(cè)定未知病毒基因序列方面雖然取得了一定效果,但其操作程序繁瑣復(fù)雜,還需要技能精湛的知識(shí)面甚廣的技術(shù)專(zhuān)家,這些要求大大限制了其推廣。Clem A L等人(2007)[11]提供了一套快速檢測(cè)和鑒定病毒的方法即多重隨機(jī)PCR:應(yīng)用3′端鎖定的隨機(jī)引物避免引物二聚體的形成,一旦監(jiān)測(cè)到病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物即可通過(guò)鳥(niǎo)槍法克隆測(cè)序鑒定。這一方法對(duì)隨時(shí)出現(xiàn)或重組的病毒進(jìn)行快速監(jiān)測(cè)和鑒定有很強(qiáng)的實(shí)用性。其方法包括將病毒樣品經(jīng)過(guò)濾、核酸酶消化后,采用多重隨機(jī)引物PCR技術(shù),其引物序列為(V8A2)5′-VVVVVVVVAA-3′,V=A,G or C,應(yīng)用這一技術(shù)成功從人的血漿中檢測(cè)并獲得了3種獨(dú)立病毒的部分序列,即腺病毒17、卡薩奇病毒A7及呼吸道合包體病毒B。這一方法的敏感性得到1 000基因/mL,可能是當(dāng)今檢測(cè)未知病毒的最快方法。

國(guó)內(nèi)李新輝、吳淑勤等[12]用隨機(jī)PCR技術(shù),選用8種帶酶切位點(diǎn)的隨機(jī)引物對(duì)懷疑是新發(fā)現(xiàn)的鱖魚(yú)病毒進(jìn)行了病毒核酸的隨機(jī)擴(kuò)增。畢勝利等人[13]用核酸序列非依賴性基因擴(kuò)大法(sequence independent single primer gene amplification,SISPA)克隆HEV基因已獲成功。周斌等[14]挑選了4種隨機(jī)引物分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 PCR和直接 PCR擴(kuò)增,結(jié)果擴(kuò)增出 3條基因片段,經(jīng)測(cè)序分析該病毒與禽腺病毒Ⅰ型-雞胚致死孤兒病毒基因組部分序列同源性高達(dá)99.5%、99.6%和99.5%,從而得知未知病毒為雞胚致死孤兒病毒,說(shuō)明肝炎病毒雞胚尿囊液受了該病毒的嚴(yán)重污染。

4 小結(jié)

隨機(jī)引物PCR技術(shù)作為遺傳多態(tài)性分析的新手段,在微生物領(lǐng)域尤其未知新病毒監(jiān)測(cè)和鑒定領(lǐng)域已經(jīng)得到成功地應(yīng)用,相信隨著隨機(jī)引物PCR技術(shù)發(fā)展,試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性問(wèn)題和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題必將得到解決,其應(yīng)用潛力也將得到進(jìn)一步的開(kāi)發(fā),必將成為病毒分子生物學(xué)研究中的重要方法之一。

[1]韋莉萍,靳士英.隨機(jī)引物 PCR基因分型方法及其在 MRSA醫(yī)院感染研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2001,7(2):78-79.

[2]劉純杰,張兆山.任意引物 PCR及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2003,14(4):320-323.

[3]Reyes G R,Kim J P.Sequence-independent,single-primer amplification(SISPA)of complex DNA populations[J].Molecular and cellular probes,1991,5(6):473-481.

[4]Allander T,Emerson S U,Engle R E,et al.A virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98(20):11609-11614.

[5]Allander T,Tammi M T,Eriksson M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(36):12891-12896.

[6]Zhang T,Breitbart M,Lee W H,et al.RNA viral community in human feces:prevalence of plant pathogenic viruses[J].PLoS Biology,2006,4(1):3.

[7]Breitbart M,Rohwer F.Method fo r discovering novel DNA viruses in blood using viral particle selection and shotgun sequencing[J].BioTechniques,2005,39(5):729-736.

[8]Jones M S,Kapoor A,Lukashov V V,et al.New DNA viruses identified in patients with acute viral infection syndrome[J].Journal of Virology,2005,79(13):8230-8236.

[9]van der Hoek L,Pyrc K,Jebbink M F,et al.Identification of a new human coronavirus[J].Nature M edicine,2004,10(4):368-373.

[10]Djikeng A,Halpin R,Kuzmickas R,et al.Viral genome sequencing by random priming methods[EB/OL].http://www.biomedcentral.com/1471-2164/9,2008.

[11]Clem A L,Sims J,Sucheta Telang S,et al.Virus detection and identification using random multiplex(RT)-PCR with 3′-locked random primers[J].Virology Journal,2007,4:65-76.

[12]李新輝,吳淑勤,李凱彬,等.8種隨機(jī)引物擴(kuò)增鱖魚(yú)核酸的初步研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,16(1):57-60.

[13]畢勝利,劉崇柏,汪媛,等.腸道傳播的非甲非乙型(戊型)肝炎病毒基因克隆的初步報(bào)告[J].病毒學(xué)報(bào),1991,1:25-28.

[14]周斌,劉華雷,曹瑞兵,等.污染疫苗的禽腺病毒分離和鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,27(3):78-80.