朱小惠，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310032)

油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)也稱(chēng)為油菜核盤(pán)菌，是一種世界性的腐生型病原真菌。該菌主要分布于溫帶和亞熱帶，寄主范圍十分廣泛，可寄生75科400多種植物［1］。此病一旦發(fā)作，常會(huì)連年發(fā)生，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降，最嚴(yán)重可以使油菜減產(chǎn)50%，嚴(yán)重影響了油菜生產(chǎn)［2］。

目前，化學(xué)農(nóng)藥是防治菌核病的主要手段，但是由于長(zhǎng)期、反復(fù)和大量使用化學(xué)農(nóng)藥存在著潛在危害，不僅會(huì)給人類(lèi)健康和環(huán)境帶來(lái)危害，而且還會(huì)帶來(lái)非靶標(biāo)生物的影響及病原菌的抗藥性等問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用拮抗微生物作為生物殺真菌劑防治油菜菌核病已經(jīng)是替代化學(xué)農(nóng)藥的潛在有效方法［3］。世界各國(guó)對(duì)油菜菌核病的致病機(jī)理、生物防治等方面進(jìn)行了大量的研究，并且已取得了可喜的成績(jī)，現(xiàn)就國(guó)內(nèi)外的研究動(dòng)態(tài)與進(jìn)展作一綜述。

1 致病機(jī)理

1.1 有關(guān)酶

1.1.1 角質(zhì)酶

寄主表皮的角質(zhì)成分是病原菌成功侵入需要突破的第1道屏障［4］。角質(zhì)酶是病菌產(chǎn)生的突破角質(zhì)層的主要工具酶，能催化角質(zhì)多聚物水解。病菌在侵入前可產(chǎn)生少量的角質(zhì)酶分解寄主表皮的角質(zhì)層，釋放少量的單體，這些單體物質(zhì)可以誘導(dǎo)角質(zhì)酶編碼基因表達(dá)，合成更多的角質(zhì)酶，加速降解寄主的表皮角質(zhì)層。

1.1.2 細(xì)胞壁降解酶

羅寬［5］認(rèn)為細(xì)胞壁是病原物侵入寄主植物的主要屏障，它的主要成分包括果膠質(zhì)、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和糖蛋白等。針對(duì)植物細(xì)胞壁中的每一種成分，植物病原物有相應(yīng)的果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶和蛋白酶等細(xì)胞壁降解酶。

果膠酶 (pectinase)。在植物病原物的細(xì)胞壁降解酶中，研究最多的是果膠酶。根據(jù)它們的作用區(qū)分，果膠酶可分為2類(lèi):果膠水解酶和裂解酶和果膠甲基酯酶。果膠水解酶的作用是斷裂α-1，4-糖苷鍵，釋放出單體半乳糖醛酸，裂解酶的作用除使糖苷鍵斷裂外，還能消除第5個(gè)碳原子上的氫，因而最終釋放出不飽和的二聚物。果膠甲基酯酶的作用是從果膠質(zhì)中除去甲基產(chǎn)生果膠酸，它還可以分解果膠鏈上的小分枝，但對(duì)果膠分子主鏈的長(zhǎng)度沒(méi)有影響［6］。果膠酶主要作用于果膠類(lèi)物質(zhì)，降解植物細(xì)胞壁中的果膠成分，導(dǎo)致組織解體從而引起軟腐、干腐、枯萎、斑點(diǎn)等癥狀。植物組織的浸解 (maceration)是軟腐病的典型癥狀，這種癥狀的發(fā)生是由于連結(jié)細(xì)胞的胞間層被病原物的酶分解，使寄主細(xì)胞彼此分離，組織軟化而呈水漬狀。植物細(xì)胞胞間層的主要成分是果膠物質(zhì)，因此人們認(rèn)為果膠酶是使組織浸解的主要因素，其中內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶和內(nèi)切果膠酸裂解酶是效率最高的酶。除浸解組織外，果膠酶還引起細(xì)胞的死亡。關(guān)于細(xì)胞死亡的原因曾經(jīng)有很多假說(shuō)，實(shí)驗(yàn)證明，果膠酶引起的細(xì)胞死亡，并不是由于果膠酶對(duì)細(xì)胞的直接殺傷作用或在降解細(xì)胞壁過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)引起的，其主要原因可能是果膠酶降解中膠層和多糖組分后，初生細(xì)胞壁松弛，壁壓下降，原生質(zhì)膜在低滲透壓下脹裂，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

纖維素酶 (cellulase)。纖維素是由葡萄糖分子鏈構(gòu)成的多糖類(lèi)化合物。核盤(pán)菌可以分泌纖維素酶將纖維素降解為可溶性纖維二糖，再由 β-葡萄糖苷酶將纖維二糖降解為葡萄糖。纖維素酶介導(dǎo)的酶促反應(yīng)的最適pH為3.0。在感病組織中，核盤(pán)菌可適應(yīng)性產(chǎn)生纖維素酶，而且感病組織中纖維素的含量隨著病程的推移逐漸下降，從而使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。劉小燕等人已經(jīng)證明油菜菌核病菌菌株的致病力強(qiáng)弱與其纖維素酶活性高低成正相關(guān)［7］。

半纖維素酶 (hemicellulase)。半纖維素是由半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等多種糖類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成的異質(zhì)多糖。半纖維素酶包括:木聚糖酶、半乳聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶等，均屬于聚糖水解酶。在這些酶的共同作用下，酶解半纖維素，破壞和分解植物細(xì)胞壁。

1.1.3 細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)含物降解酶

植物病原菌還能產(chǎn)生一些降解細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的酶，如蛋白酶、脂酶、淀粉酶等，用以降解蛋白質(zhì)、類(lèi)脂和淀粉等成分。核盤(pán)菌產(chǎn)生的蛋白酶可以降解寄主原生質(zhì)和細(xì)胞壁中的蛋白組分，破壞植物細(xì)胞壁糖蛋白，利于病菌入侵，這種酶在許多感病寄主組織中都有發(fā)現(xiàn)，接種2 d后就可檢測(cè)到蛋白酶活性，10 d后蛋白酶的活性最高［8－9］。

1.2 致病機(jī)制

官春云［10］認(rèn)為在整個(gè)病程中，病菌的營(yíng)養(yǎng)可能是決定病菌在寄主中建立寄生關(guān)系成敗的重要因素，侵染前底物的可利用性是侵染成功的先決條件。病菌侵入組織后，需要大量的能源，只有豐富的易利用的營(yíng)養(yǎng)才能提供病原菌的生長(zhǎng)繁殖。纖維素酶、半纖維素酶、外PG、磷脂酶、蛋白質(zhì)水解酶和其他酶類(lèi)在發(fā)病過(guò)程中可能起一種分解寄主組織提供營(yíng)養(yǎng)的作用。降解細(xì)胞壁的纖維素酶可由病菌的分枝菌絲產(chǎn)生，使細(xì)胞廣泛被降解，從而提供了豐富的可利用的碳水化合物，使侵染菌絲能在細(xì)胞間充分分支與定植，接種后第2天侵染組織中纖維素含量減少，就是一個(gè)例證，半纖維素酶也一樣。病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生細(xì)胞外酶所需的氮源可能由磷脂酶和蛋白酶提供。

草酸在病原菌的致病性、與環(huán)境微生物的競(jìng)爭(zhēng)、養(yǎng)分的獲得、毒素的調(diào)節(jié)及木質(zhì)素的降解上發(fā)揮著重要作用［11］。Debary最先提出，草酸作為一種菌核病菌分泌的有毒代謝物與菌核病致病性有關(guān)，隨后 Max Well等［12－13］從被侵染的大豆組織中檢測(cè)到草酸鹽的存在。吳純?nèi)实龋?4－15］對(duì)感病寄主組織中草酸的積累和分布晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，進(jìn)一步證明了草酸在油菜菌核病致病中的作用，發(fā)現(xiàn)不同感病程度的組織內(nèi)草酸含量的變化不同。草酸的作用機(jī)理至今尚不清楚，據(jù)推測(cè)主要有以下幾點(diǎn):草酸降低了寄主細(xì)胞的pH值，從而有利于病菌的細(xì)胞壁降解酶的活性，加速了寄主細(xì)胞解體。因?yàn)檫@些酶如內(nèi)或外PG，纖維素酶，半纖維素酶都是酸性酶;草酸抑制了與抗性有關(guān)的酶和光合作用的酶活性;草酸和鈣結(jié)合成草酸鈣晶體有可能堵塞導(dǎo)管或微管束而導(dǎo)致萎蔫;草酸對(duì)寄主細(xì)胞的直接毒害作用，表現(xiàn)在草酸有強(qiáng)的離子螯合能力，能改變寄主細(xì)胞膜透性，引起電解質(zhì)喪失，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，為病菌提供了營(yíng)養(yǎng)和生存環(huán)境。

綜上所述，核盤(pán)菌產(chǎn)生的多種酶類(lèi)和毒素-草酸，是導(dǎo)致植物發(fā)病，組織死亡的重要原因，并且酶 (內(nèi)PG、蛋白酶)和毒素-草酸與菌株致病成正相關(guān)。

2 生物防治及作用機(jī)制

生物防治會(huì)對(duì)病原植物真菌和植物產(chǎn)生直接或者間接的影響，拮抗微生物防治植物病害所涉及的因素很多，其作用方式也各有不同，目前研究得比較清楚的主要有以下4個(gè):拮抗作用、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗病性。至今人們已分離篩選到對(duì)油菜菌核病有不同防治效果的各類(lèi)微生物，有些已經(jīng)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段。

2.1 拮抗作用

拮抗微生物通過(guò)產(chǎn)生特異性或者非特異性的代謝產(chǎn)物或者抗生素來(lái)抑制或者破壞病原菌的生長(zhǎng)。木霉 (Trichodermaspp.)能產(chǎn)生很多拮抗物質(zhì)［16］，木霉菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種水解酶和抗生素。如幾丁質(zhì)酶 (chitinase)、纖維素酶(cellulase)、木聚糖酶 (xylanese)、葡聚糖酶(glucanase)和蛋白酶 (proteinase)可抑制病菌孢子萌發(fā)，引起菌絲崩解。次生代謝產(chǎn)生的抗生素主要有木霉素 (trichodermin)、膠毒素 (gliotoxin)、綠木霉素 (viridin)、膠綠木霉素 (glioviridin)和抗菌肽 (peptideantibiotic)等［17］，這些次生代謝物可以抑制植物病原菌的生長(zhǎng)而發(fā)揮其生防作用，其中木霉素具有抑制核盤(pán)菌生長(zhǎng)和子囊盤(pán)產(chǎn)生的作用。

產(chǎn)生抗生素及細(xì)胞外細(xì)胞壁分解酶是粘帚霉屬(Gliocladiumspp.)抗真菌的重要機(jī)制之一［18］。綠色粘帚霉 (Gliocladium virens)能夠產(chǎn)生抗真菌代謝物如膠霉毒素 (gliocladiu)、綠膠霉素(gliovirin)。暴增海等研究表明粘帚霉發(fā)酵液能夠降低菌核病的發(fā)病率，防治效果達(dá)到80%以上［19］。目前已從盾殼霉 (Coniothyrium minitans)培養(yǎng)濾液中鑒定出至少3類(lèi)代謝物質(zhì):3(2H)-苯丙呋喃酮類(lèi)、色烷類(lèi)［20］和 macrosphelide A［21］。其中，macrosphelide A是最主要的代謝物質(zhì)，對(duì)核盤(pán)菌的IC50為46.6 mg·kg－1。此外，盾殼霉培養(yǎng)液中還存在β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，這些酶可降解核盤(pán)菌菌絲及菌核擬薄壁組織的細(xì)胞壁［22］。毛殼菌 (Chaetomiumspp.)產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)chaetoglobusinC可以有效的抑制菌核病，chaetoviridins A和B能夠抑制菌核病菌絲的生長(zhǎng)［23］。周樂(lè)聰?shù)龋?4］篩選出紅蛋巢菌 BNF71 和BNFl37菌株，其培養(yǎng)液對(duì)油菜菌核病具有良好的防治效果，防效分別達(dá)98.8%和86.1%，這2株生防菌具有較高的木聚糖酶活性，而另一株菌BNF134具有顯著的外幾丁質(zhì)酶活性。

Femando等［25］研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌30-84菌株在Kanner培養(yǎng)基中產(chǎn)生吩嗪類(lèi)抗生素，可以完全抑制核盤(pán)菌菌核的產(chǎn)生。Thomashow等［26］發(fā)現(xiàn)熒光假單胞2-79RN10產(chǎn)生的吩嗪類(lèi)抗生素能抑制核盤(pán)菌菌絲的生長(zhǎng)。江木蘭等［27］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)BY-2能產(chǎn)生2種類(lèi)型的抗真菌物質(zhì)，一種是揮發(fā)性的物質(zhì)，可以有效地抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng);另一種是分泌到培養(yǎng)液中的物質(zhì)，試驗(yàn)證明BY-2產(chǎn)生和積累的高效抑制油菜菌核病菌生長(zhǎng)的細(xì)胞外分泌型物質(zhì)，其發(fā)酵上清液與油菜菌核病菌對(duì)峙培養(yǎng)形成了2.8 cm的抑菌圈。

孫啟利等［28］研究表明地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)W10培養(yǎng)菌液和濾液對(duì)油菜菌核病

菌具有較強(qiáng)的頡頑能力。經(jīng)硫酸銨沉淀和透析而提取的W10抗菌蛋白顯著抑制病菌生長(zhǎng)，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?00 μg·mL－1時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率在90%以上，而且菌核不能產(chǎn)生，處理菌核后菌核萌發(fā)推遲，明顯抑制子囊孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)。Liping Yang等［29］研究發(fā)現(xiàn)青霉菌PY-1產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)能夠抑制核盤(pán)菌菌絲生長(zhǎng)，抗菌物質(zhì)經(jīng)乙酸乙酯萃取和高效液相色譜的分離后，出現(xiàn)2個(gè)活性組分。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)作用

微生物間的競(jìng)爭(zhēng)作用發(fā)生在當(dāng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成為限制性因子的條件下［30］。對(duì)于一些生長(zhǎng)較快的生防真菌如木霉菌和葡萄孢來(lái)講，空間和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)可能是防治病害的一個(gè)重要的機(jī)制，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)和消解某些毒性物質(zhì)，達(dá)到控制病害的目的。木霉菌屬于腐生型真菌，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快，能夠迅速利用營(yíng)養(yǎng)和占據(jù)空間。研究表明:無(wú)論采用土壤處理還是種子處理，木霉都能夠很容易地沿著被處理植物的根系生長(zhǎng)。在離子饑餓狀態(tài)下，木霉能分泌高效率的鐵載體來(lái)螯合環(huán)境中的離子，競(jìng)爭(zhēng)土壤中有限的營(yíng)養(yǎng)成分從而抑制病原微生物的生長(zhǎng)［31］。從油菜花瓣上分離的葡萄孢菌能快速生長(zhǎng)，迅速占領(lǐng)花瓣空間，從而阻止核盤(pán)菌子囊孢子的定殖，減輕菌核病的發(fā)生［32］。另外，盾殼霉能在油菜和苜蓿等植物的花瓣上抑制核盤(pán)菌子囊孢子的定殖及其侵染葉片或果莢［33］。

2.3 重寄生作用

重寄生作用是生防真菌防治植物病害過(guò)程中一個(gè)普遍的現(xiàn)象。其中盾殼霉因其專(zhuān)一性強(qiáng)，作用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)植物無(wú)致病性等特點(diǎn)而被認(rèn)為是最具開(kāi)發(fā)潛力的生防菌之一［34］。盾殼霉的菌絲可直接穿透核盤(pán)菌菌絲和菌核，導(dǎo)致菌核組織破壞和解體，胞質(zhì)裂解，變空，胞壁溶解，而其自身正常［35］。通過(guò)光學(xué)顯微鏡，透射電鏡 (TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察發(fā)現(xiàn)，盾殼霉通過(guò)機(jī)械壓力侵入皮層細(xì)胞壁并破壞細(xì)胞內(nèi)含物，侵入髓部菌絲時(shí)則是依靠酶解和機(jī)械壓力的共同作用。盾殼霉分泌的與降解寄主的細(xì)胞壁相關(guān)的酶主要是 β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶。Giczey等［36］克隆了盾殼霉的 β-1，3-葡聚糖酶基因cmgL，并發(fā)現(xiàn)在寄生菌核的過(guò)程中，cmgL的表達(dá)增強(qiáng)，可見(jiàn)這種酶是盾殼霉寄生核盤(pán)菌過(guò)程中的關(guān)鍵酶。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為木霉菌在侵染穿透寄主真菌的過(guò)程中所產(chǎn)生的真菌細(xì)胞壁降解酶(幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶等)起著直接作用，又以幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的作用為重要。Davet等［37］認(rèn)為，木霉的 β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活力越高，對(duì)核盤(pán)菌的重寄生作用越強(qiáng)。此外，學(xué)者還專(zhuān)門(mén)研究了作用于菌核上的重寄生菌。馬桂珍等［38］在研究大豆菌核病菌菌核重寄生菌時(shí)，經(jīng)大量篩選獲得一株對(duì)菌核有強(qiáng)寄生能力的鏈孢粘帚霉菌株 (G.catenulatum)HL-1-1，該菌株室內(nèi)對(duì)菌核的寄生率達(dá)100%，被寄生菌核不能萌發(fā)，并使90%以上的菌核腐爛，溫室盆栽試驗(yàn)對(duì)核盤(pán)菌引起的大豆菌核病防效達(dá)80%以上，在寄生菌核的過(guò)程中能分泌大量的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶。食菌核葚孢霉 (Sporidesmium sclerotivorum)是1978年美國(guó)農(nóng)業(yè)部研究人員在研究萵苣菌核病菌(Scterotinia minor)時(shí)，于馬里蘭州首次發(fā)現(xiàn)的［39］，該菌是一種專(zhuān)門(mén)寄生于多種核盤(pán)菌科真菌菌核上的重寄生菌，通過(guò)機(jī)械力侵入菌核皮層后，菌絲在皮層和髓部的細(xì)胞間活躍地生長(zhǎng)。食菌核葚孢霉寄主專(zhuān)化性強(qiáng)，僅專(zhuān)性寄生于某些核盤(pán)菌科真菌的菌核上，寄生率高，在小核盤(pán)菌菌核密度為每100 g土壤616個(gè)時(shí)，接種劑量為每1 g土壤5個(gè)大孢子即可成功侵染［40］。

2.4 誘導(dǎo)抗性

植物在遇到有害生物侵襲時(shí)，能形成一種獨(dú)特的防御系統(tǒng)［41］。基于不同類(lèi)型，不同來(lái)源和不同數(shù)量的刺激源，宿主植物的誘導(dǎo)抗性可以是局部的誘導(dǎo)抗性 (過(guò)敏性反應(yīng))或者是系統(tǒng)的誘導(dǎo)抗性［42］。Dean 等［43］在 1989 年發(fā)現(xiàn)綠色木霉在以 D-木糖、木聚糖或者天然植物細(xì)胞壁制備物為原始碳源的培養(yǎng)基中，能夠產(chǎn)生木聚糖酶，植物在木聚糖酶作用下，具有明顯的防御反應(yīng)，能夠增強(qiáng)對(duì)植物真菌的抗性。殼寡糖作為近幾年研究較多的一種植物誘抗劑，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于煙草、棉花、油菜等作物生產(chǎn)中。尹恒等［44］首次進(jìn)行了殼寡糖對(duì)油菜抗菌核病的研究，證實(shí)了殼寡糖使油菜對(duì)菌核病產(chǎn)生抗性主要是因?yàn)闅す烟钦T導(dǎo)油菜產(chǎn)生了系統(tǒng)抗性。邱業(yè)先等［45］在篩選油菜菌核病抗性誘導(dǎo)菌過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)桃褐腐病菌對(duì)油菜離體葉片和盆栽植株均不致病，但經(jīng)誘導(dǎo)接種后，可明顯誘導(dǎo)植株對(duì)菌核病的抗性，當(dāng)用油菜菌核病菌進(jìn)行激發(fā)接種后，接種植株僅表現(xiàn)輕微癥狀，其莖、葉發(fā)病率和病情指數(shù)遠(yuǎn)低于未經(jīng)誘導(dǎo)的植株。

3 展望

核盤(pán)菌的侵染循環(huán)具有土傳和氣傳雙重特征，菌核能頑固地存活于土壤中越冬和越夏，菌核還可通過(guò)種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，這種流行特點(diǎn)給菌核病的防治帶來(lái)了困難。認(rèn)識(shí)核盤(pán)菌致病機(jī)制，可以尋找抗病基因以獲得轉(zhuǎn)基因植物來(lái)進(jìn)行遺傳改良，以達(dá)到防治核盤(pán)菌的目的。

盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)核盤(pán)菌生防菌研究較多，但真正登記注冊(cè)的生防制劑很少。迄今為止，形成制劑的生防菌主要為盾殼霉。主要有:俄羅斯1989年研制出用于防治向日葵菌核病的盾殼霉制劑coniothyrin，德國(guó)和瑞士研究用于防治蔬菜及大田作物菌核病的 conitans盾殼霉商品制劑 (德國(guó)Prophyta Biologisoher Ptanzenschutz公司)，以及匈牙利研制用于防治溫室及園藝作物菌核病的KON(bioveditd sligetszontmiklos)盾殼霉商品制劑。此外印度Biotech International公司生產(chǎn)的綠色木霉可濕性粉劑可用于菌核病的防治［46］。pseudomonas cepacia和bacillus subtilis制劑已在臺(tái)灣注冊(cè)用于防治棉花立枯病和油菜菌核?。?7］。

隨著人們?cè)絹?lái)越關(guān)注食品的安全性，繼續(xù)開(kāi)發(fā)和挖掘其他的有益微生物和具有安全性的植物源拮抗活性物質(zhì)資源將成為未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

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