中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 符運(yùn)勤 刁其玉 屠 焰＊

1 瘤胃微生物區(qū)系及其作用

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲息著復(fù)雜、多樣、非致病的各種微生物，包括瘤胃原蟲、瘤胃細(xì)菌和厭氧真菌，還有少數(shù)噬菌體（馮仰廉，2004）。瘤胃微生物的種類極為多樣，每毫升瘤胃內(nèi)容物中有不同種類細(xì)菌1010～1011個(gè)、原蟲105～106個(gè)、厭氧真菌（游離孢子數(shù)為103～105，包括6個(gè)屬）和噬菌體（顆粒數(shù)為 105～ 106個(gè)）（王夢芝等，2008）。 它們在反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵過程中起著關(guān)鍵作用，所以研究瘤胃微生物區(qū)系對提高反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)管理水平和生產(chǎn)性能有重要意義。

反芻動(dòng)物出生時(shí)其消化道不存在厭氧細(xì)菌、厭氧真菌和原蟲，而后隨著與母體及環(huán)境的不斷接觸，瘤胃及其他消化道部位逐漸建立微生物區(qū)系。細(xì)菌是最早出現(xiàn)在瘤胃中的微生物，動(dòng)物出生24 h后其瘤胃壁即有兼性厭氧細(xì)菌等存在，出生2 d后瘤胃內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)格厭氧微生物。在成年前，反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)細(xì)菌菌群發(fā)生很大變化 （馮仰廉，2004）。經(jīng)過適應(yīng)和選擇，只有少數(shù)微生物能在消化道定植、存活和繁殖，并隨幼畜的生長和發(fā)育，形成特定的微生物區(qū)系（馮仰廉，2004）。瘤胃微生物間相互作用，維持瘤胃功能的穩(wěn)定，瘤胃微生物區(qū)系保持動(dòng)態(tài)平衡是保證瘤胃健康的前提。因此，對反芻動(dòng)物生長過程中瘤胃微生物的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行研究，了解瘤胃代謝和微生物之間的關(guān)系，并進(jìn)行有益的調(diào)控，將促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃健康發(fā)育，從而保障成年后的生產(chǎn)性能，也為合理應(yīng)用飼料、開辟新的飼料資源提供理論依據(jù)。

2 瘤胃微生物區(qū)系的多樣性與分析技術(shù)

2.1 瘤胃微生物多樣性的研究 早期對瘤胃細(xì)菌的研究基于人工培養(yǎng)的方法，存在一定的局限性。當(dāng)前人們對瘤胃中微生物的認(rèn)識只有10%～20%，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)代分子技術(shù)也開始逐漸滲透到瘤胃微生物的研究中來，大大推動(dòng)了瘤胃微生態(tài)領(lǐng)域的研究。近年發(fā)展起來的免培養(yǎng)結(jié)合16S rDNA的變性梯度凝膠電泳方法逐步克服了常規(guī)培養(yǎng)方法的不足（Muyzer，1999）。前人利用分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢分別對犢牛、成年奶牛和羊等進(jìn)行了瘤胃微生物多樣性的研究。

2.1.1 犢牛瘤胃微生物多樣性 于萍等（2009）測定了60～120 d犢牛胃腸道纖維分解菌，認(rèn)為脂解厭氧弧桿菌是犢牛斷奶后消化道中的優(yōu)勢菌之一，不僅是十二指腸中唯一檢測到的菌群，而且在其他腸道中的數(shù)量也超過琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌等。在瘤胃、十二指腸、空腸和回腸等前段消化道中均未檢測到黃色瘤胃球菌，僅在后段腸道結(jié)腸和盲腸中檢測到該菌的存在。而龍淼等（2009）利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和分子生物學(xué)定量法對犢牛瘤胃干酪乳桿菌進(jìn)行分離鑒定并對其相關(guān)耐酸基因進(jìn)行克隆，為下一步研制瘤胃微生態(tài)制劑及構(gòu)建瘤胃內(nèi)耐酸的乳酸分解基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。

2.1.2 成年奶牛和成年肉牛瘤胃微生物多樣性王遠(yuǎn)亮等（2005）采用免培養(yǎng)技術(shù)對常規(guī)飼養(yǎng)條件下奶牛瘤胃微生物多樣性進(jìn)行了初步分析，通過對瘤胃微生物16S rDNA序列的分析，初步構(gòu)建了部分瘤胃微生物的系統(tǒng)發(fā)育樹，為更好地利用瘤胃微生物基因資源和奶牛營養(yǎng)研究提供了一些基本數(shù)據(jù)和材料。而鞏慶亮等（2008）采用PCR-16S rDNA鑒定和動(dòng)態(tài)檢測奶牛瘤胃液細(xì)菌種類，共分離到56株，對其中7株具有代表性的細(xì)菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，經(jīng)序列同源性比較，最終把細(xì)菌鑒定為牛鏈球菌（A0625、A1212、0131）、蠟樣芽孢桿菌（0113）、地衣芽孢桿菌（0091）、短小芽孢桿菌（0083）和嗜熱鏈球菌（0123）。 裴彩霞等（2008）采用3對古菌特異性引物擴(kuò)增瘤胃古菌16S rRNA基因分別建立克隆庫來研究晉南牛瘤胃古菌的多樣性，試驗(yàn)結(jié)果提示瘤胃中存在大量的未知產(chǎn)甲烷菌。

2.1.3 不同品種羊瘤胃微生物多樣性 石鵬君等（2007）采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)對波爾山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、四川南江黃羊瘤胃細(xì)菌優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)14條16S rDNA序列中有4條克隆的序列與基因庫最相似菌的相似性大于97%，其中13條與未鑒定菌或未培養(yǎng)菌的序列相似性最高，說明瘤胃中存在著豐富的未鑒定或不可培養(yǎng)細(xì)菌種類。從中可以發(fā)現(xiàn)3種山羊瘤胃細(xì)菌具有一定的相似性，種內(nèi)個(gè)體間相似性明顯高于種間相似性，這說明寄主品種是影響瘤胃細(xì)菌種群構(gòu)成的一個(gè)重要因素。

綜合反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系的研究來看，人們利用傳統(tǒng)與免培養(yǎng)技術(shù)對犢牛、成年奶牛、肉牛、羊瘤胃優(yōu)勢菌群、瘤胃微生物多樣性和瘤胃中微生物的功能基因進(jìn)行了部分研究并取得了一定進(jìn)展，但對反芻動(dòng)物瘤胃中菌群的建立，特別是隨月齡、日糧形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律上的報(bào)道很少。隨著對反芻動(dòng)物瘤胃微生物研究的深入，對犢牛和后備牛瘤胃微生物區(qū)系的研究將顯得越來越重要，而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為此提供了技術(shù)上的保障。

2.2 瘤胃微生物區(qū)系分析技術(shù) 研究瘤胃微生物區(qū)系的方法一般分為瘤胃微生物傳統(tǒng)定量方法（滾管計(jì)數(shù)法和最大或然數(shù)法）和分子生物學(xué)定量方法（郭同軍等，2009）。

2.2.1 傳統(tǒng)定量方法 采用Hungate（1969）發(fā)展起來的厭氧培養(yǎng)技術(shù)，以及采用模擬瘤胃環(huán)境而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，對瘤胃微生物進(jìn)行分離、純培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、形態(tài)鑒定、生理生化特性的鑒別、分類等。瘤胃細(xì)菌與真菌的數(shù)量用顯微鏡直接計(jì)數(shù)，常采用滾管法計(jì)數(shù)，以及最大或然數(shù)計(jì)數(shù)法（most probable number，MPN）。

2.2.1.1 亨蓋特厭氧滾管技術(shù) 亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特（Hungate）于1950年首次提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù)。通過此培養(yǎng)技術(shù)可以研究瘤胃微生物的多樣性，楊舒黎（2007）采用滾管法研究了日糧中添加胡麻油和豆油對奶牛瘤胃纖維分解菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌和總細(xì)菌數(shù)量變化。但此培養(yǎng)技術(shù)還存在局限性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)瘤胃微生物都是厭氧的，而保持絕對厭氧條件是一件很難辦到的事，非常不經(jīng)濟(jì)，正因?yàn)槿绱?，目前在?shí)驗(yàn)室能純培養(yǎng)出的瘤胃微生物是有限的，純培養(yǎng)技術(shù)還有待改進(jìn)。

2.2.1.2 最大或然數(shù)（MPN）計(jì)數(shù)法 MPN法適用于測定微生物群落中不占優(yōu)勢、但具有特殊生理功能的微生物類群的數(shù)量。 廣泛用于測定土壤、水體等環(huán)境中氨化、硝化、反硝化、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化等特殊微生物生理類群和藻類的數(shù)量，以及牛奶等食品中的特殊微生物類群（如大腸桿菌）的數(shù)量；還可用于檢測環(huán)境中某些基因工程菌株的數(shù)量 （崔戰(zhàn)利等，2005）。Dehority等（1989）首次將MPN用于瘤胃細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該法與滾管法的總細(xì)菌數(shù)無差異；Theodorou等（1990）將改良的MPN用于瘤胃厭氧真菌的計(jì)數(shù)，研究結(jié)果表明，MPN法計(jì)數(shù)結(jié)果與滾管法相似，但與游動(dòng)孢子直接記數(shù)的結(jié)果有很大差異。最大或然數(shù)對接種等試驗(yàn)技能要求較低，液體培養(yǎng)基制備和接種所需時(shí)間較短，可直觀觀察生長情況，最終pH也易于檢測。此外，MPN法對液相和固相中的真菌均能可靠計(jì)數(shù)，對產(chǎn)生游動(dòng)孢子少的厭氧真菌的計(jì)數(shù)更適用。MPN的缺點(diǎn)是不能對微生物進(jìn)行分離研究。

2.2.2 分子生物學(xué)定量方法 隨著人們對瘤胃微生物原位生存狀態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)常規(guī)的分離培養(yǎng)方法很難全面地評估微生物群落多樣性。從瘤胃中簡單提取和厭氧培養(yǎng)計(jì)數(shù)，不能得到微生物在瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中的生活特征和生態(tài)功能的信息。20世紀(jì)80年代以來，以小核糖體RNA16S rRNA為主的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用分子生物學(xué)方法研究瘤胃微生物生態(tài)克服了基于培養(yǎng)方法帶來的局限，加快了對瘤胃微生物群落的了解。

2.2.2.1 變性 （或溫度）梯度凝膠電泳 目前DGGE技術(shù)已經(jīng)成為微生物群落遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)性分析的強(qiáng)有力工具，在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中廣泛地應(yīng)用于比較微生物群落的多樣性和監(jiān)視種群動(dòng)態(tài)（淡瑞芳等，2007）。DGGE技術(shù)對瘤胃細(xì)菌的研究主要集中于分析瘤胃細(xì)菌的多樣性、比較不同品種動(dòng)物瘤胃細(xì)菌的多樣性和研究不同飼養(yǎng)條件對瘤胃細(xì)菌的影響 （謝林君等，2009）。DGGE技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是無需進(jìn)行體外培養(yǎng)，直接利用微生物樣品中的DNA或RNA對微生物群體加以區(qū)別，可以很準(zhǔn)確地判斷出它們之間的種屬關(guān)系，甚至還可能發(fā)現(xiàn)尚未分離鑒定的微生物。但不足之處是它只能檢測微生物區(qū)系中數(shù)量上的優(yōu)勢種，在總DNA模板中某一種微生物的DNA含量小于1%時(shí)，難以用其檢測出來；另外，它只能對不同種的微生物DNA序列進(jìn)行分離，而不能確定各DNA序列中突變的位置及相關(guān)信息，最終還得依賴于DNA測序分析（李啟琳等，2008）。

2.2.2.2 基于16S/18S rRNA的核苷酸 （基因）探針雜交技術(shù)定量瘤胃微生物 點(diǎn)雜交和狹線雜交技術(shù)是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，最早出現(xiàn)于1979年，是將原始樣品中的總RNA或幾種核酸樣品分別定量固定在固相支持物 （尼龍膜或纖維素膜）上，然后用特異的探針與樣品雜交，通過估計(jì)樣品點(diǎn)信號強(qiáng)度，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品信號強(qiáng)度進(jìn)行比較，確定待測樣品中靶序列的量；也可通過通用探針和特異探針在相同條件下分別對同一樣品進(jìn)行雜交后的相應(yīng)信號強(qiáng)度比來計(jì)算特異探針?biāo)鶎?yīng)的靶RNA占通用探針?biāo)鶎?yīng)的靶RNA的百分含量。王海榮等（2006）利用定量雜交法檢測綿羊瘤胃纖維細(xì)菌，試驗(yàn)將提取的總RNA濃度系列稀釋后與通用細(xì)菌探針進(jìn)行雜交，檢測結(jié)果所做的回歸分析表明，雜交信號與尼龍膜上的所點(diǎn)的量具有明顯線性關(guān)系。同時(shí)對幾份瘤胃樣品進(jìn)行種纖維分解菌的初步定量檢測，結(jié)果顯示種纖維分解菌的相對豐度與前人報(bào)道相似，表明該方法能夠?qū)α鑫讣?xì)菌進(jìn)行定量分析，可在后續(xù)相關(guān)研究中使用。但分子雜交法結(jié)果重現(xiàn)性差，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不可靠。

2.2.2.3 其他分子生物學(xué)定量方法 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，還出現(xiàn)了一些其他的微生物多樣性的定量方法。主要有熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、定量PCR和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)定量檢測等先進(jìn)手段。分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，在許多方面改善了傳統(tǒng)的研究方法。應(yīng)用鑒于16S rRNA的方法研究瘤胃細(xì)菌及真菌的多樣性，使得許多原來難以培養(yǎng)的菌株得以發(fā)現(xiàn)。

傳統(tǒng)的厭氧培養(yǎng)方法只能認(rèn)識一小部分瘤胃微生物，大部分微生物不能培養(yǎng)，使得瘤胃微生物多樣性嚴(yán)重被低估，而且要求條件比較高，比如要求嚴(yán)格厭氧，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16S/18S rRNA/rDNA已經(jīng)成功地用于瘤胃微生物生態(tài)研究中，通過 DGGE、雜交、FISH、競爭PCR和實(shí)時(shí)定量PCR來檢測微生物區(qū)系的變化，確定瘤胃微生物特別是細(xì)菌的數(shù)量。但這些分子技術(shù)也有其自身局限性，DGGE只能檢測微生物區(qū)系中數(shù)量上的優(yōu)勢種，在總DNA模板中某一種微生物的所有DNA含量小于1%時(shí)，難以用其檢測出來；如果以1010個(gè)/mL瘤胃食糜計(jì)算，分子雜交方法最低檢測到總菌的0.01%，而競爭PCR可檢測到總菌的0.00001%。但目前由于可利用的寡核苷酸的探針數(shù)量很少，所以分子雜交獲得的信息是十分有限的。對于競爭性PCR，由于很難建造內(nèi)標(biāo)，因此應(yīng)用性不強(qiáng)，而實(shí)時(shí)定量PCR比傳統(tǒng)PCR是一種很有希望的研究手段，在微生物的定量中有很光明的應(yīng)用前景。分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)越性并不能完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)來研究瘤胃微生物，兩種方法應(yīng)在研究瘤胃微生物多樣性中相輔相成。

2.3 益生菌對瘤胃發(fā)育的促進(jìn)作用

2.3.1 瘤胃發(fā)育與微生物之間相互依賴 犢牛瘤胃的發(fā)育受多種因素影響，如犢牛日齡、飼料組成及形態(tài)、揮發(fā)性脂肪酸、瘤胃的pH值以及瘤胃微生物等，這些因素相互作用、相互牽制，共同影響瘤胃的形態(tài)發(fā)育。其中飼料組成及其物理形態(tài)是外因，瘤胃食糜pH值變化是內(nèi)因，揮發(fā)性脂肪酸的組成比例不同是直接原因，而瘤胃微生物變化是根本原因（張海濤等，2008）?？梢娏鑫肝⑸飬^(qū)系的建立和保持動(dòng)態(tài)平衡是瘤胃發(fā)育之關(guān)鍵，因此為保障反芻動(dòng)物瘤胃微生物健康，前人采用各種方法來調(diào)控瘤胃，其中包括控制原蟲數(shù)量來調(diào)控瘤胃發(fā)酵、通過基因工程改造瘤胃微生物和添加瘤胃調(diào)控劑。瘤胃調(diào)控劑用得較多的有微生物制劑、脲酶抑制劑、離子載體、礦物質(zhì)元素、維生素以及醚類化合物鹵代物等。微生物制劑用得較多的是活性酵母添加物，枯草芽孢桿菌和一些復(fù)合菌制劑，這些微生物制劑以其無污染、無殘留和明顯的作用效果已引起了很多研究者的關(guān)注。

大量研究及生產(chǎn)實(shí)踐證明，益生菌能維持動(dòng)物胃腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)微生物區(qū)系；也有報(bào)道說在幼齡動(dòng)物日糧中添加益生菌能夠影響動(dòng)物消化道中的固有菌群種類及數(shù)量，進(jìn)而提高動(dòng)物的免疫力。對益生菌作用機(jī)制認(rèn)識目前有：（1）加強(qiáng)黏膜屏障；（2）抗菌效應(yīng)；（3）影響免疫系統(tǒng)；（4）抑制腸道疾?。ㄔS珂和魏萍，2009）。但由于目前的技術(shù)方法研究益生菌難度大，對這些機(jī)制還不是很清楚。

2.3.2 益生菌對瘤胃微生物的作用 研究證實(shí)，在動(dòng)物飼料中添加益生菌可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，保持腸道微生態(tài)平衡、防治畜禽疾病，促進(jìn)畜禽生長、擴(kuò)大飼料來源、提高飼料轉(zhuǎn)化率，凈化環(huán)境、改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，并可減少或取代抗生素的用量。研究表明，在產(chǎn)奶牛飼料中投入地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物能夠?yàn)槟膛Ｌ峁┍容^好的瘤胃微生物生長因子，提高奶牛瘤胃細(xì)菌總數(shù)，降低其氨態(tài)氮濃度，提高瘤胃微生物對氨的利用，提高總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量和乙酸丙酸比例，降低瘤胃發(fā)酵的甲烷產(chǎn)量，在生產(chǎn)性能上則表現(xiàn)為提高產(chǎn)奶量和乳蛋白含量（喬國華和單安山，2008）。日糧中添加納豆芽孢桿菌，可促進(jìn)斷奶后犢牛瘤胃及腸道中主要的纖維分解菌琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和脂解厭氧孤桿菌在消化道中的定植和生長；而飼喂產(chǎn)奶牛時(shí)具有提高產(chǎn)奶量、改善乳脂率、提高乳蛋白率、增加牛奶中干物質(zhì)含量和降低牛奶中體細(xì)胞數(shù)的作用 （欒廣春等，2008）。其他益生菌方面，Chaucheyras-Durand等（2008）在對酵母菌及其培養(yǎng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，活性干酵母對幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物的活性有積極作用，可以維持瘤胃pH穩(wěn)定和防止瘤胃酸中毒，同時(shí)提高生長性能和瘤胃纖維分解菌的活性；酵母培養(yǎng)物可以改善荷斯坦?fàn)倥Ｎ改c道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)消化，提高犢牛對日糧粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的全消化道消化率，因此可以提高平均日增重、改善體尺指標(biāo)（閆曉剛等，2005）；米曲霉提取物和釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)物提高了水牛牛犢營養(yǎng)物質(zhì)腸道表觀消化率，同時(shí)日增重也有所提高（Di Francia等，2008）；在綿羊上酵母添加物可減少瘤胃甲烷產(chǎn)生，延緩精料和干草飼糧下綿羊瘤胃能量的釋放（Mwenya等，2004）。而飼喂羔羊單一和復(fù)合活酵母培養(yǎng)物均可提高瘤胃微生物蛋白的合成，改善飼料轉(zhuǎn)化率，羔羊日增重分別提高了21%和 16%（Tripathi和Karim，2010）。

3 結(jié)束語

瘤胃微生物對瘤胃發(fā)育有很重要的作用，但目前在犢牛、青年牛瘤胃發(fā)育，尤其是微生物區(qū)系發(fā)生、發(fā)展上的研究尚不完善，因此，對于反芻動(dòng)物瘤胃系統(tǒng)，從簡單到復(fù)雜，需要開展系統(tǒng)的犢牛-青年牛瘤胃微生物的發(fā)生發(fā)展研究。而近代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為研究瘤胃微生物提供了更為有效、簡便的方法，也為逐步打開“瘤胃黑箱”提供了可能。

[1]崔戰(zhàn)利，王萍萍，王秋菊.最大或然數(shù)法在光合細(xì)菌計(jì)數(shù)中的應(yīng)用及效果研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（8）：1577 ～ 1580.

[2]淡瑞芳，張海濤，龍瑞軍，等.瘤胃微生物生態(tài)研究方法評述[J].草業(yè)科學(xué)，2007，24（7）：77 ～ 82.

[3]馮仰廉.反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2004.64～121.

[4]鞏慶亮，王振勇，柴同杰，等.奶牛瘤胃需氧及兼性厭氧菌的PCR-16SrDNA 鑒定及日糧的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（10）：1367 ～ 1372.

[5]郭同軍，王加啟，王建平，等.瘤胃微生物定量方法的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（4）：19 ～ 24.

[6]李啟琳，李燕鵬，王士長.DGGE技術(shù)在瘤胃微生物多態(tài)性研究中的應(yīng)用[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，29（3）：101 ～ 103.

[7]龍淼，逢曉陽，邢欣，等.犢牛瘤胃干酪乳桿菌分離鑒定及其耐酸相關(guān)基因 ffh 的克隆[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（6）：752 ～ 754，766.

[8]欒廣春，王加啟，卜登攀，等.納豆芽孢桿菌對泌乳期奶牛產(chǎn)奶量、牛奶品質(zhì)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（9）：58 ～ 61.

[9]裴彩霞，毛勝勇，朱偉云.晉南牛瘤胃中古菌分子多樣性的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2008，48（1）：8 ～ 14.

[10]喬國華，單安山.益生素對奶牛生產(chǎn)性能及瘤胃發(fā)酵影響的研究[J].中國奶牛，2007，3：10 ～ 14.

[11]石鵬君，柏映國，袁鐵錚，等.應(yīng)用rpoB和16 SrDNA基因的變性梯度凝膠電泳技術(shù)對山羊瘤胃細(xì)菌多樣性的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47（2）：285～289.

[12]王海榮，侯先志，高愛武，等.利用定量雜交法檢測綿羊瘤胃纖維細(xì)菌的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（3）：7 ～ 10.

[13]王夢芝，徐愛秋，李世霞，等.瘤胃微生物類群的多樣性及其綜合發(fā)酵的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè)，2008，29（15）：7 ～ 9.

[14]王遠(yuǎn)亮，楊瑞紅，毛愛軍，等.采用未培養(yǎng)技術(shù)對荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌多樣性進(jìn)行初步分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（6）：915 ～ 919.

[15]謝林君，鄧衛(wèi)東，毛華明.DGGE技術(shù)在瘤胃細(xì)菌微生態(tài)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，08（上）：56 ～ 57.

[16]閆曉剛.酵母培養(yǎng)物和顆粒精料對荷斯坦?fàn)倥ＩL發(fā)育的影響：[碩士學(xué)位論文][D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[17]于萍，王加啟，卜登攀，等.日糧添加納豆芽孢桿菌對斷奶后犢牛胃腸道纖維分解菌的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（1）：111 ～ 116.

[18]楊舒黎.日糧添加豆油和胡麻油對奶牛瘤胃細(xì)菌及發(fā)酵參數(shù)的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[19]張海濤，王加啟，卜登峰，等.影響犢牛瘤胃發(fā)育的因素研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2008，2：86 ～ 89.

[20]Chaucheyras-Durand F，Walker N D，Bach A.Effects of active dry yeasts on the rumen microbial ecosystem：Past，present and future[J].Animal Feed Science and Technology，2008，145：5 ～ 26.

[21]Di Francia A，Masucci F，De Rosa G，et al.Effects of Aspergillus oryzae extract and a Saccharomyces cerevisiae fermentation product on intake，body weight gain and digestibility in buffalo calves[J].Animal Feed Science and Technology，2008，140：67 ～ 77.

[22]Dehority B A，Tirabasso P A，Grifo A P.Most-probable-number procedures for enumerating ruminal bacteria，including the simultaneous estimation of total and cellulolytic numbers in one medium[J].Applied and Environmental Microbiology，1989，55（11）： 2789~2792.

[23]Hungate R E.A roll tube method for cultivation of strict anaerobes[M].In：Norris J R，Ribbons D W（eds）.Methods in Microbiology.Vol 3B.London and New York：Academic Press，1969，117~132.

[24]Muyzer G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems[J].Curr Opin Microbiol，1999，2：317 ～ 322.

[25]Mwenya B，Santoso B，Sar C，et al.Effects of including β1-4 galactooligosaccharides，lactic acid bacteria or yeast culture onmethanogenesis as well as energy and nitrogen metabolism in sheep[J].Animal Feed Science and Technology，2004，115：313 ～ 326.

[26]Tripathi M K，Karim S A.Effect of individual and mixed live yeast culture feeding on growth performance，nutrient utilization and microbial crude protein synthesis in lambs[J].Animal Feed Science and Technology，2010，155：163～171.

[27]Theodorou M K，Gill M，King-Spooner，et al.Enumeration of anaerobic chytridiomycetes as thallus forming units:novel method for quantification of fibrolytic fungal populations from the digestive tract ecosystem[J].App Environ Microbiol，1990，56：1073~1078.