劉 晶

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100026）

腸球菌是條件致病菌,廣泛存在于自然界,常棲居在人、動(dòng)物的腸道和女性生殖道,很少引起嚴(yán)重的感染。近年來(lái),隨著廣譜抗生素的大量使用,腸球菌成為醫(yī)院感染的三大病原菌之一,能夠引起心內(nèi)膜炎、菌血癥和尿路感染等[1]。對(duì)于嚴(yán)重的腸球菌感染臨床上常采用細(xì)菌細(xì)胞壁活性抗菌藥物,如青霉素或糖肽類(lèi)藥物,與氨基糖苷類(lèi)抗生素聯(lián)合治療[2]。但當(dāng)腸球菌獲得氨基糖苷類(lèi)耐藥基因介導(dǎo)產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)修飾酶,會(huì)對(duì)高濃度氨基糖苷類(lèi)產(chǎn)生耐藥性,從而失去與細(xì)菌細(xì)胞壁活性抗菌藥物的協(xié)同作用[2],加大了治療的難度。在耐藥菌中以慶大霉素高水平耐藥腸球菌(HLGR）為主,故全面了解腸球菌的耐藥機(jī)制及耐藥性的傳遞特性,對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗生素,新抗生素的研發(fā)起著重要作用。

1 慶大霉素修飾酶及其基因特點(diǎn)

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS）建議,腸球菌對(duì)慶大霉素高耐藥的標(biāo)準(zhǔn)是MIC〉500 μ g/ml。氨基糖苷類(lèi)修飾酶(AME）是造成高耐藥產(chǎn)生的主要原因。目前報(bào)道的高耐慶大霉素的氨基糖苷修飾酶主要有以下幾種:

1.1 雙功能酶 AAC(6′）-APH(2″）雙功能酶 AAC(6′）-APH(2″）是目前為止發(fā)現(xiàn)的最重要的AME,腸球菌對(duì)慶大霉素高水平耐藥幾乎都由此酶介導(dǎo),由耐藥基因aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia 編碼[3],普 遍認(rèn) 為 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因存在腸球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌中,基因序列號(hào)M13771,開(kāi)放閱讀框(ORF）1 437 bp。Joseph等證實(shí)aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia是2個(gè)基因的融合體,只含有一個(gè)起始密碼子和一個(gè)終止密碼子。這兩種基因在結(jié)構(gòu)上是完整統(tǒng)一的,但各自發(fā)揮作用而不增強(qiáng)對(duì)方的耐藥活性。AAC(6′）-APH(2″）可以介導(dǎo)對(duì)慶大霉素、妥布霉素、地貝卡星、奈替米星、阿米卡星、異帕米星及福提米星的耐藥,但鏈霉素不受影響[4]。由于AAC(6′）-APH(2″）雙功能酶使腸球菌對(duì)除鏈霉素以外的幾乎所有氨基糖苷藥物高度耐藥(MIC〉500 μ g/ml）,因此對(duì)高耐氨基糖苷類(lèi)腸球菌的篩選,一般僅用慶大霉素和鏈霉素即可,如腸球菌產(chǎn)AAC(6′）-APH(2″）雙功能酶則消除了這些抗生素與作用于細(xì)胞壁藥物的協(xié)同殺菌作用。

1.2 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2″）-Ic:aph(2″）-Ic基因最初發(fā)現(xiàn)于雞腸球菌中,隨后在屎腸球菌和糞腸球菌中也被發(fā)現(xiàn)[2]。攜帶aph(2″）-Ic基因的腸球菌對(duì)慶大霉素呈中等水平耐藥,但是能夠破壞氨芐西林與慶大霉素的協(xié)同作用[5]。因此,應(yīng)用濃度為500 μ g/ml慶大霉素檢測(cè)其耐藥基因(破壞與作用于細(xì)胞壁藥物的協(xié)同作用）,攜帶aph(2″）-Ic基因的腸球菌就被漏檢,可能錯(cuò)誤地認(rèn)為氨基糖苷與作用于細(xì)胞壁藥物有協(xié)同作用。另一方面,因?yàn)?56μ g/ml和 500 μ g/ml之間呈2倍的稀釋濃度關(guān)系,攜帶aph(2″）-Ic基因的菌株在使用500μ g/ml慶大霉素篩查試驗(yàn)隨時(shí)可以輕微的生長(zhǎng)。這些菌株可能被錯(cuò)誤地認(rèn)為攜帶aac(6＇）-Ie-aph(2″）-Ia基因,這樣,錯(cuò)誤地認(rèn)為對(duì)多種氨基糖苷耐藥,其實(shí)他們對(duì)于氨芐西林與阿米卡星、奈替米星或者地貝卡星的協(xié)同效應(yīng)是敏感的。

1.3 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2″）-Id APH(2″）-Id由Susan F.Tsai等[6]于1998年首次報(bào)道,是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的氨基糖苷修飾酶,由 aph(2″）-Id編碼,基因序列號(hào):AF016483,ORF是906 bp。APH(2″）-Id可以修飾慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、耐替米星和地貝卡星,而且MIC均大于2 000 mg/L。在協(xié)同殺菌試驗(yàn)中,對(duì)僅含有APH(2″）-Id的腸球菌,未檢測(cè)到氨芐西林加慶大霉素或耐替米星的協(xié)同作用,但同樣劑量的氨芐西林加阿米卡星或新霉素卻顯示了協(xié)同殺菌作用。

1.4 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2″）-Ib APH(2″）-Ib由Susan J.Kao等[7]于2000年首次報(bào)道,APH(2″）-Ib是在屎腸球菌SF11770中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高耐慶大霉素的基因,基因序列號(hào)是:AF207840,ORF是897 bp。APH(2″）-Ib介導(dǎo)了腸球菌對(duì)慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星和地貝卡星高水平耐藥,消除了氨芐西林與慶大霉素的協(xié)同殺菌作用。攜帶APH(2″）-Ib的菌株在理論上應(yīng)對(duì)氨芐西林與阿米卡星的聯(lián)合用藥敏感,在對(duì)屎腸球菌SF11770的協(xié)同殺菌試驗(yàn)中,氨芐西林與慶大霉素?zé)o協(xié)同作用,但氨芐西林與阿貝卡星顯示了一定的協(xié)同作用,其在體內(nèi)的有效性需進(jìn)一步證實(shí)。

1.5 氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(6′）-Im 在屎腸球菌SF11770種發(fā)現(xiàn)的一種新的耐藥基因[8],其位于aph(2″）-Ib下游44bp處,而且aph(2″）-Ib和aac(6′）-Im 是各自獨(dú)立的2個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF）,擁有各自的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。aac(6′）-Im 編碼產(chǎn)生 AAC(6′）-Im,與雙功能酶中的 AAC(6′）-Ie的結(jié)構(gòu)域 80%相似,56%相同。當(dāng) aph(2″）-Ib和 aac(6′）-Im同時(shí)存在時(shí),對(duì)某些氨基糖苷類(lèi)耐藥性明顯比各自單獨(dú)存在時(shí)要高。

1.6 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2″）-Ie APH(2″）-Ie是由瞿婷婷等[9]于2006年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,APH(2″）-Ie是在鉛黃腸球菌HZ95中發(fā)現(xiàn)的最新的高耐慶大霉素的基因,基因序列號(hào):AY677166,ORF是905 bp。研究發(fā)現(xiàn),在屎腸球菌和鶉雞腸球菌中也檢測(cè)到這個(gè)基因。APH(2″）-Ie可導(dǎo)致對(duì)慶大霉素及奈替米星的高水平耐藥,但并不介導(dǎo)鏈霉素、阿米卡星的耐藥性。

2 耐藥基因的轉(zhuǎn)移

氨基糖苷類(lèi)基因借助于轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)元件在同種或不同種細(xì)菌間傳播,抗菌藥物不合理應(yīng)用是導(dǎo)致耐藥相關(guān)基因傳播的重要原因。

2.1 質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性轉(zhuǎn)移

目前,研究較多的是性信息素應(yīng)答性質(zhì)粒,主要存在于糞腸球菌中,并在糞腸球菌間傳遞,菌體間的轉(zhuǎn)移頻率可高達(dá)100-10-2(每個(gè)供體菌所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化結(jié)合子的數(shù)目）。另一種與耐藥質(zhì)粒相關(guān)的質(zhì)粒是多宿主質(zhì)粒,它可以跨種屬進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,但轉(zhuǎn)移頻率較低。最近,在屎腸球菌中還發(fā)現(xiàn)了一種質(zhì)粒pMG1(65.1 kb）,它既有別于信息素應(yīng)答性質(zhì)粒,不被信息素誘導(dǎo);也有別于多宿著質(zhì)粒,轉(zhuǎn)移頻率達(dá)到10-4。pMG1可在糞腸球菌間、屎腸球菌間、糞腸球菌與屎腸球菌間、屎腸球菌與海瑞腸球菌間轉(zhuǎn)移,顯示其在腸球菌間有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。

2.2 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥性轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)座子是位于染色體或質(zhì)粒上的一種可以獨(dú)立于質(zhì)粒存在的可轉(zhuǎn)移性基因序列。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子是一個(gè)插入序列(IS）,它含有編碼轉(zhuǎn)座過(guò)程必須遺傳信息的基因,如:轉(zhuǎn)座酶基因。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子有兩端的插入序列及中心區(qū)的獲得性基因,如:耐藥基因。在腸球菌中發(fā)現(xiàn)了多種含有 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia并類(lèi)似于Tn4001的復(fù)合型轉(zhuǎn)座子,如Tn5281及其類(lèi)似結(jié)構(gòu)、缺陷型Tn4001樣結(jié)構(gòu)、Tn5384等。

Tn5281[10]:1991年Hodel-Christian等[11]首先在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)Tn5281,之后在屎腸球菌、鶉雞腸球菌和棉子糖腸球菌等多種腸球菌中也有發(fā)現(xiàn)。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子Tn5281與金黃色葡萄球菌Tn4001和無(wú)乳鏈球菌Tn3706具有相同的結(jié)構(gòu),由兩個(gè)互為反向重復(fù)序列的插入序列IS256連接在雙功能的氨基糖苷修飾酶基因aac(6'）-Ie-aph(2”）-Ia兩側(cè)構(gòu)成。IS256編碼的轉(zhuǎn)座酶能識(shí)別IS256末端的反向重復(fù)序列,催化轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)。轉(zhuǎn)座子Tn5281的變異型較多,主要表現(xiàn)為左側(cè)或右側(cè)的 IS256缺失型、Tn5281-IS257雜交型和缺陷型Tn4001。腸球菌中HL GR基因主要位于Tn5281上[20],轉(zhuǎn)座子可整合于接合質(zhì)粒上,從而促進(jìn)了HLGR基因在菌株間的散播。

Tn5384[12]:是糞腸球菌CH116中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)26 kb的轉(zhuǎn)移元件,是第1個(gè)報(bào)道的雙功能修飾酶基因與其他耐藥基因共轉(zhuǎn)移的例子。此轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)中共有3個(gè)IS256,其中2個(gè)位于雙功能修飾酶基因兩側(cè),形成類(lèi)似Tn4001的結(jié)構(gòu),第3個(gè)IS256位于最左端插入位點(diǎn)下游23 kb處,它與第2個(gè)IS256中間可能有耐紅霉素基因定位。

Tn5385[13]:是整合入糞腸球菌CH19和CH116染色體上的1個(gè)更大的轉(zhuǎn)座子,它含有多種轉(zhuǎn)座子樣結(jié)構(gòu)(Tn5281、Tn5384、Tn4001、Tn552）及插入序列(IS256、IS257、IS1216）,整個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)的兩端為正相重復(fù)的IS1216。含有多種耐藥基因:aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia、ant(6′）-Ia、β -內(nèi)酰胺酶 基因,以及對(duì)紅霉素、升汞、四環(huán)素、米諾環(huán)素的耐藥基因。Tn5385轉(zhuǎn)移到糞腸球菌受體菌中的頻率低,且通過(guò)染色體重組出現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)移菌類(lèi)型。

Tn924[14]:是位于糞腸球菌SF350染色體上的一個(gè)高水平慶大霉素耐藥轉(zhuǎn)座子,可通過(guò)共存的接合質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,不含質(zhì)粒的只在染色體上有Tn924的菌株不能轉(zhuǎn)移其耐藥性?；蛉L(zhǎng)27 kb,可能含有類(lèi)似截?cái)嗟腡n4001-IS257雜交結(jié)構(gòu)。

3 耐藥機(jī)理研究的實(shí)驗(yàn)室方法

根據(jù)NCCLS的標(biāo)準(zhǔn),腸球菌在含慶大霉素 500 μ g/ml的BHI肉湯中,經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng),有細(xì)菌生長(zhǎng)或瓊脂培養(yǎng)基中有超過(guò)1個(gè)菌落生長(zhǎng),即為高水平耐藥。

3.1 修飾酶活性檢測(cè)氨基糖苷修飾酶的酶活性檢測(cè)一般采用磷酸纖維素膜結(jié)合測(cè)定法(phosphocellulose paperbinding assay）,不同放射性元素標(biāo)記的乙酰輔酶A、ATP在修飾酶的作用下,將放射性元素轉(zhuǎn)移到吸附于磷酸纖維素膜的慶大霉素上,通過(guò)放射性計(jì)數(shù)檢測(cè)酶的活性。

3.2 耐藥基因的檢測(cè)通過(guò) PCR[15,21]、探針雜交[16,20]等方法進(jìn)行。

3.3 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)性信息素介導(dǎo)的高頻質(zhì)粒轉(zhuǎn)移試驗(yàn)可在BHI肉湯中進(jìn)(broth mating法）,對(duì)于非信息素介導(dǎo)的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移試驗(yàn)可借助固體表面進(jìn)行。

3.4 轉(zhuǎn)座子的檢測(cè)采用兩種方法:①Long-PCR[17,20]:是通過(guò)長(zhǎng)距離PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(L-PCR-RFLP）,分析轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)變異。②巢氏PCR(Nested-PCR）技術(shù)[18]。

4 結(jié)束語(yǔ)

隨著氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的廣泛流行,特別是腸球菌中的aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因,使得氨基糖苷類(lèi)藥物聯(lián)合應(yīng)用治療受到限制。目前,大部分腸球菌對(duì)慶大霉素高水平耐藥,絕大多數(shù)對(duì)鏈霉素也高水平耐藥,這就導(dǎo)致腸球菌實(shí)際上對(duì)臨床上所有常用的氨基糖苷類(lèi)藥物都產(chǎn)生耐藥。因此,要求加強(qiáng)新藥的研究、開(kāi)發(fā)。阿比卡星是一種新的氨基糖苷類(lèi)藥物,是迪比卡星的衍生物,目前只在日本用來(lái)治療對(duì)慶大霉素和新青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌感染,阿比卡星受雙工能酶AAC(6′）-APH(2″）介導(dǎo)影響的幾率要比慶大霉素小的多,因此在治療一些含有 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因的腸球菌感染中可能有用[2]。利奈唑胺是一種新的化學(xué)結(jié)構(gòu)惡唑烷酮類(lèi)藥物,有望用來(lái)治療嚴(yán)重的腸球菌感染[19]。

[1]Treitman AN,Yarnold PR,Warren J,et al.Emerging incidence of Enterococcus faecium among hospital isolates[J].J ClinMicrobiol,2005,43(1）:462.

[2]Chow JW.Aminoglycoside resistance in enterococci[J].Clin Infect Dis,2000,31(2）:586.

[3]Ferretti JJ,Gilmore KS,Courvalin P.Nucleotide sequence analysis of the genespecifying the bifunctional 6＇-aminoglycoside acetyltransferase 2”-aminoglycosidephosphotransferase enzyme in Streptococcus faecalis and identification and cloning of gene regions specifying the two activities[J].J Bacteriol,1986,167(2）:631.

[4]Leclercq R,Dutka-Malen S,Brisson-No?l A,et al.Resistance of enterococci to aminoglycosides and glycopeptides[J].Clin Infect Dis,1992,15(3）:495.

[5]Chow JW,ZervosMJ,Lerner SA,et al.A novel gentamicin resistance gene in Enterococcus[J].Antimicrob Agents Chemother,1997,41(3）:511.

[6]Tsai SF,Zervos MJ,Clewell DB,et al.A new high-level gentamicin resistance gene,aph(2”）-Id,in Enterococcus spp J.Antimicrob Agents Chemother,1998,42(5）:1229.

[7]Kao SJ,You I,Clewell DB,et al.Detection of the high-level aminoglycoside resistance gene aph(2”）-Ib in Enterococcus faecium[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(10）:2876.

[8]Chow JW,Kak V,You I,et al.Aminoglycoside Resistance Genes aph(2”）-Ib and aac(6'）-Im detected together in strains of both Escherichia coli and Enterococcus faecium[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(10）:2691.

[9]瞿婷婷,張 櫻,俞云松,等.一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的腸球菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aph(2”）-Ie[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(9）:596.

[10]Byrne ME,Gillespie MT,Skurray RA.Molecular analysis of a gentamicin resistance transposonlike element on plasmids isolated from North American Staphylococcus aureus strains[J].Antimicrob Agents Chemother,1990,34(11）:2106.

[11]Hodel-Christian SL,Murray BE.Characterization of the gentamicin resistance transposon Tn5281 from Enterococcus faecalis and comparison to staphylococcal transposons Tn4001 and Tn4031[J].Antimicrob Agents Chemother,1991,35(6）:1147.

[12]Rice LB,Carias LL,Marshall SH.Tn5384,a composite enterococcal mobile element conferring resistance to erythromycin and gentamicin whose ends are directly repeated copies of IS256[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39(5）:1147.

[13]Rice LB,Carias LL.Transfer of Tn5385,a composite,multiresistance chromosomal element from Enterococcus faecalis[J].J Bacteriol,1998,180(3）:714.

[14]Thal LA,Chow JW,Clewell DB,et al.Tn924,a chromosome-borne transposon encoding high-level gentamicin resistance in enterococcus faecalis[J].Antimicrob Agents Chemother,1994,38(5）:1152.

[15]Vakulenko SB,Donabedian SM,Voskresenskiy AM,et al.Multiplex PCR for detection of aminoglycoside resistance genes in enterococci[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(4）:1423.

[16]Huycke MM,Spiegel CA,Gilmore MS.Bacteremia caused by hemolytic,high-level gentamicin-resistant Enterococcus faecalis[J].Antimicrob A-gents Chemother,1991,35(8）:1626.

[17]Simjee S,Manzoor SE,Fraise AP,et al.Nature of transposon-mediated high-level gentamicin resistance in Enterococcus faecalis isolated in the United Kingdom[J].J Antimicrob Chemother,2000,45(5）:565.

[18]Saeedi B,Nilsson M,et al.Genetic relatedness among Enterococcus faecalis with transposon-mediated high-level gentamicin resistance in Swedish intensive care unit[J].J Antimicrob Chemother,2003,52(2）:162.

[19]Metallidis S,Chatzidimitriou M,Nikolaidis P,et al.Compartitive in vitro activity of linezolid and five other antimicrobials against nosocomial isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus,methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis and vancomycin-resistant Enterococcus faecium[J].J Chemother,2003,15(5）:442.

[20]Feizabadi MM,Shokrzadeh L,Sayady S,et al.Transposon Tn5281 is the main distributor of the aminoglycoside modifying enzyme gene among isolates of Enterococcus faecalis in Tehran hospital[J].Can J Microbiol,2008,54(10）:887.

[21]Leelaporn A,Yodkamol K,Waywa D,et al.A novel structure of Tn4001-truncated element,type V,in clinical enterococcal isolates and multiplex PCR for detectingaminoglycoside resistance genes[J].International Journal of Antimicrobial Agents,2008,31(3）:250.

[22]Arias CA,Murray BE.Emergence and managemeng of drug-resistant enterococcal infections[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2008,6(5）:637.