余姍姍 馬麗麗 徐善全 陳博 卜碧濤

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢430030)

神經(jīng)元的原代培養(yǎng)是進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能研究的重要手段。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的研究較多,但關(guān)于小腦 Purkinje細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道較少。Purkinje細(xì)胞是小腦唯一的傳出神經(jīng)元,許多神經(jīng)變性疾病如C型Niemann-Pick病 (NPC)與Purkinje細(xì)胞的變性、死亡關(guān)系密切。因此,在體外條件下建立 Purkinje細(xì)胞培養(yǎng)體系,并研究其電生理特性,對(duì)明確這些疾病的發(fā)病機(jī)制十分重要。本研究旨在原有 Purkinje細(xì)胞原代培養(yǎng)基礎(chǔ)上加以改進(jìn),探索一種簡(jiǎn)便易行的 Purkinje細(xì)胞培養(yǎng)方法,并初步研究其細(xì)胞電生理特性,為深入研究神經(jīng)變性疾病的病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1材 料

1.1 動(dòng)物:出生24h時(shí)內(nèi)的Balb/C乳鼠,雌雄不限。(由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)

1.2 主要試劑:細(xì)胞專用多聚賴氨酸 (Sigma);DMEM/F12(Gibco BRL LifeTechnologies);胎牛血清 (Hyclone);DNaseⅠ (Sigma);谷氨酰胺 (2μmol/l)(Sigma);N2(Sigma);T3(Sigma);免疫染色一抗:Anti-0albindin-D-28K(1:3000) (Sigma);免疫染色二抗:GAM Cy3(1:250) (Sigma);復(fù)染劑DAPI(1:1000)(Sigma).

2 方法

2.1 培養(yǎng)皿的預(yù)處理:

采用35mm培養(yǎng)皿,每個(gè)培養(yǎng)皿放入小圓玻片3-4枚,加入0.1%多聚賴氨酸 (每一玻片滴加一滴為宜)包被2h,用前吸去多聚賴氨酸,用HBSS清洗2次后備用。

2.2 小鼠小腦Purkinje細(xì)胞原代培養(yǎng):

采用 Toshihide Tabata等[1]的方法,略做改進(jìn)。取生后24h內(nèi)的Balb/C乳鼠,75%酒精消毒皮膚后,用一手固定乳鼠頭部及四肢,一手分層剪開皮膚和顱骨,盡量充分暴露雙側(cè)大小腦;用眼科彎鑷從大腦頂端將腦組織完整剝離后放入預(yù)先置于超凈臺(tái)內(nèi)的含冰冷 HBSS的稱量瓶中;分離小腦并移入另一含冰冷 HBSS的稱量瓶,小心去除腦膜和血管;將小腦組織移入含有少量 HBSS的無(wú)菌青霉素瓶?jī)?nèi),用眼科剪將腦組織剪成1立方毫米大小的小塊,加入0.1%胰蛋白酶 (約為組織塊體積的10倍)用巴氏管輕柔吹打數(shù)次,蓋好橡皮塞,于37°恒溫培養(yǎng)箱消化11-13min(組織塊變疏松,顏色變淺,有時(shí)可見粗線狀白色漂浮出現(xiàn));消化完畢,吸去含胰酶的 HBSS液,加入含有12mmol/L MgSO4和5μ/ml DNAseⅠ的 HBSS液終止消化,用吸管輕柔吹打至組織分散均勻后靜置5min;用吸管吸取細(xì)胞懸液至標(biāo)準(zhǔn)篩過濾;將濾液移入無(wú)菌離心管內(nèi)1200 rpm 4°離心5min;吸棄上清,先加入少量含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,輕輕吹打重新懸浮,取1-2μl細(xì)胞懸液于99μl 0.2%-0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液中,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算存活和死亡的細(xì)胞數(shù),從而測(cè)定細(xì)胞密度 (細(xì)胞計(jì)數(shù):活體細(xì)胞具有排斥臺(tái)盼藍(lán)的能力,而死亡細(xì)胞則能吸收臺(tái)盼藍(lán)變成藍(lán)色);以培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至所需的細(xì)胞密度 (5×106cell/ml以上),接種細(xì)胞至經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中,置于含5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中;培養(yǎng)24h后,用含有1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺而不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液一次;以后每3d半定量換液一次。

2.3 原代Purkinje細(xì)胞免疫熒光染色步驟:

從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)皿,用彎鑷從培養(yǎng)皿中夾取長(zhǎng)有細(xì)胞的小圓玻片,用4%冷多聚甲醛室溫固定15-20min;PBS洗滌2次,每次5min;3%H2O2/0.25%TritonX-100破膜30min;PBS洗滌3次,每次 5min;10%BSA封閉 1h;加入一抗(Calbindin-D-28K抗體)4°C孵育過夜;PBS洗滌3次,每次5min;加入二抗孵育1h;PBS洗滌3次,每次5min;加入三抗DAPI孵育10-15s;PBS洗滌3次,每次5min;50%甘油封片后熒光顯微鏡照相。

2.4 膜片鉗全細(xì)胞記錄:

與實(shí)驗(yàn)當(dāng)日將微電極玻璃毛坯 (南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)經(jīng)兩步拉制成尖端為1-2μm的微電極,充灌細(xì)胞內(nèi)液后入水電阻為2-5MΩ,補(bǔ)償液接電位;鏡下選擇表面光滑,胞內(nèi)無(wú)顆粒的健康Purkinje細(xì)胞,調(diào)節(jié)三位操縱器將電極移至細(xì)胞上方,稍施負(fù)壓,形成高阻抗封接 (R>1GΩ)后,c-三ast補(bǔ)償 (70%-90%);負(fù)壓破膜后 (R<50MΩ)形成全細(xì)胞記錄模式,調(diào)節(jié)c-slow,G-series補(bǔ)償;脈沖信號(hào)經(jīng)放大器放大后經(jīng)電極絲和充灌液體的微電極導(dǎo)入細(xì)胞,產(chǎn)生的電流信號(hào)經(jīng)放大器轉(zhuǎn)換,軟件處理后存于計(jì)算機(jī)內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)過程中,細(xì)胞外液中加入河豚毒 (TTX)1μmol/l阻斷鈉電流,細(xì)胞鉗制電壓為-80mv,給細(xì)胞施以10mv,300ms的去極化脈沖刺激,可引出一內(nèi)向電流。.

2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:

實(shí)驗(yàn)記錄電流曲線用patch軟件進(jìn)行測(cè)量處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示,采用 SPSS 15.0 for Window單樣本t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.小 鼠小腦Purkinje細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置相差顯微鏡下,剛接種的神經(jīng)元呈圓形,透亮,體積較小,單個(gè)分散分布;接種6-12h后部分細(xì)胞可貼壁,呈圓形,胞體亮,并可觀察到少部分細(xì)胞開始伸出小的突起;培養(yǎng)24h后可見細(xì)胞全部貼壁,且大部分細(xì)胞長(zhǎng)出突起;第2-3天細(xì)胞胞體逐漸增大,突起增多變長(zhǎng);第5-7天神經(jīng)元胞體明顯增大,呈梨形,折光性強(qiáng),胞漿豐富,核大,核仁隱約可見,從胞體一側(cè)頂端發(fā)出2-3條粗的主樹突,樹突分支繁多,形似扇形,軸突自胞體底端發(fā)出,細(xì)而直,無(wú)分支,細(xì)胞突起間相互交織成網(wǎng)狀,神經(jīng)元的生長(zhǎng)已比較成熟。

圖1 A培養(yǎng)3d的蒲肯野細(xì)胞 (×40)B培養(yǎng)7d的蒲肯野細(xì)胞 (×40)Fig.1 A Purkinje cell cultured for three days(×40)Fig.1 B Purkinje cell cultured for seven days (×40)

2.神 經(jīng)元的免疫熒光法鑒定

利用Purkinje細(xì)胞特異性Calbindin-D-28K抗體熒光免疫染色,陽(yáng)性細(xì)胞胞漿和突起呈紅色,突起纖細(xì),延長(zhǎng);DAPI染胞核著藍(lán)色。陰性對(duì)照組無(wú)細(xì)胞著色。細(xì)胞學(xué)鑒定陽(yáng)性率可達(dá)70%以上。

圖2 培養(yǎng)5d的Purkinje細(xì)胞免疫熒光染色 (左:Calbindin-D-28K染色×100;右:albindin-D-28K染色后DAPI復(fù)染×40)Fig.2 Purkinje cell cultured for 5 days,immunofluorescence staining(left:Calbindin-D-28K stained ×100; right:Calbindin-D-28Kcounter stained with DAPI Staining)

3.培 養(yǎng)神經(jīng)元高電壓依賴性鈣通道電流特征:

膜片鉗記錄顯示,培養(yǎng)的神經(jīng)元易于封接,成功率在90%以上。在全細(xì)胞模式下,鉗制電壓為-80mV,刺激電壓為10mV,時(shí)間為300ms,電壓鉗記錄細(xì)胞高電壓依賴性混合性鈣通道,記錄的內(nèi)向電流平均值為68.4±3.34pA(n=80)。該電流可被N型、L型、T型鈣通道阻滯劑部分抑制,推測(cè)為混合型鈣通道。

圖3 Purkinje細(xì)胞高電壓依賴性鈣通道電流 (ICa)Fig.3 High-voltage-一ependent Calcium channel currents of Purkinje cell

討 論

原代神經(jīng)元在體外發(fā)育成熟后,仍保持和接近在體細(xì)胞的各項(xiàng)生理參數(shù)[8],具有良好的生物可利用性,因此,神經(jīng)元的原代培養(yǎng)特別適用于形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究。一般說(shuō)來(lái),神經(jīng)元的體外培養(yǎng)取材于孕鼠胚胎組織較為理想,因在神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育過程中,神經(jīng)元的增殖始于胚胎期;且胚胎期神經(jīng)細(xì)胞分化程度很低,體外存活能力很強(qiáng)[5]。但取材于胎鼠,胎齡不易確定;需對(duì)孕鼠進(jìn)行剖宮手術(shù),增加污染機(jī)會(huì),且對(duì)種鼠再生能力有一定影響;胎鼠個(gè)體很小,腦組織取材操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)難度增加。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選用生后24h內(nèi)Balb/C乳鼠為研究對(duì)象,進(jìn)行體外培養(yǎng),獲得成功并通過膜片鉗技術(shù)鑒定細(xì)胞電生理特性良好。這就明顯縮短取材時(shí)間,簡(jiǎn)化操作步驟,從而降低原代培養(yǎng)難度。

由于小腦Purkinje細(xì)胞體外生存能力較為脆弱,而且容易退化[3]。因此,在分離培養(yǎng)過程中,更需注意其中的關(guān)鍵操作步驟:1.取腦方法:消毒后直接剪開皮膚和顱骨,暴露腦組織后迅速完整剝離至含冰冷的HBSS的培養(yǎng)皿中,而非斷頭處死后取腦組織[1],縮短神經(jīng)元缺氧時(shí)間;且整個(gè)分離取材及剝離血管腦膜過程均在冰上操作,動(dòng)作盡量輕巧迅速,最大可能保證神經(jīng)元的活力。2.酶消化法:選用低濃度 (0.1%)胰蛋白酶,嚴(yán)格控制胰酶用量及消化時(shí)間,我們經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)摸索發(fā)現(xiàn),一只小鼠小腦組織約使用1ml胰蛋白酶消化12min較為合適,此時(shí)細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)最佳。3.機(jī)械分離:在培養(yǎng)過程中,要數(shù)次使用吸管機(jī)械分離,有研究表明,反復(fù)的吹打過程對(duì)細(xì)胞的損傷遠(yuǎn)較酶消化為大。因此,要盡量減少吸管吹打次數(shù),以能分散細(xì)胞又不影響細(xì)胞活力為最佳,而且用吸管輕柔吹打細(xì)胞時(shí),盡量不起泡沫,因?yàn)榧?xì)胞在氣液界面不能存活,氣泡過多會(huì)影響神經(jīng)元活性。4.接種密度:T oshihide T abata的研究指出,在接種密度為5×106cell/ml的條件下,Purkinje細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,而且Purkinje細(xì)胞長(zhǎng)期存活主要依賴于種植密度而非膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。為此,我們?cè)诮臃N前用臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞密度,提高細(xì)胞存活率。5.半量換液:細(xì)胞接種24h后全量換液,以后每3d半定量換液一次。及時(shí)換液有助于維持細(xì)胞生長(zhǎng)活性,且半量換液既可提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),又可保證神經(jīng)元相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境。注意每次換液前,要預(yù)熱培養(yǎng)基,換液時(shí)動(dòng)作輕柔。

目前,國(guó)內(nèi)外神經(jīng)元培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基分含血清和無(wú)血清[1]兩類。血清是培養(yǎng)基中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),對(duì)神經(jīng)元的附著、生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖有明顯的促進(jìn)作用[8]。有研究證實(shí),早期使用添加10%胎牛血清的DMEM/F12,Purkinje細(xì)胞容易貼壁并且數(shù)量增加1.5倍[2]。但在血清長(zhǎng)期培養(yǎng)條件下,膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分裂增殖旺盛,可抑制神經(jīng)元生長(zhǎng),且隨著血清濃度的增加,神經(jīng)元比例減少。綜合考慮,我們?cè)谏窠?jīng)元培養(yǎng)早期采用添加10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的DMEM/F12作為接種培養(yǎng)基,待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后過渡為添加1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺的DMEM/F12維持培養(yǎng)。且為了保證神經(jīng)元的活性以滿足膜片鉗操作需要,培養(yǎng)過程中不使用阿糖胞苷類有絲分裂抑制劑,減少藥物對(duì)神經(jīng)元的毒副作用,使神經(jīng)元的生長(zhǎng)更接近體內(nèi)自然環(huán)境。多次試驗(yàn)證明采用此培養(yǎng)體系可培養(yǎng)出形態(tài)典型,生理功能良好的神經(jīng)元。

研究結(jié)果表明,應(yīng)用本文介紹的培養(yǎng)方法可以獲得生長(zhǎng)狀態(tài)較好,活性較好的神經(jīng)元,且取材容易,操作簡(jiǎn)便。

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