夏蒲，徐小燕，賈寶萍，王薇，關(guān)一夫，高野康雄，鄭華川

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 檔案館，沈陽(yáng) 110001；4.日本富山大學(xué) 醫(yī)學(xué)部病理診斷教室，日本 富山 930-0194）

胃黏膜特異表達(dá)JC病毒T抗原質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)鑒定

夏蒲1，徐小燕2，賈寶萍3，王薇2，關(guān)一夫1，高野康雄4，鄭華川1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 檔案館，沈陽(yáng) 110001；4.日本富山大學(xué) 醫(yī)學(xué)部病理診斷教室，日本 富山 930-0194）

目的 利用鼠胃黏膜上皮細(xì)胞中高活性的角蛋白19（K19）啟動(dòng)子構(gòu)建K19-JCVT抗原表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定。方法 利用PCR方法突變JC病毒T抗原中的NdeⅠ位點(diǎn)，并在兩端插入BclⅠ位點(diǎn)，通過(guò)BamHⅠ位點(diǎn)將DNA片段與K19啟動(dòng)子連接，構(gòu)建K19-JCVT抗原質(zhì)粒。利用酶切和DNA測(cè)序確認(rèn)其DNA序列。免疫組化篩選細(xì)胞角蛋白19陽(yáng)性胃癌細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞角蛋白19表達(dá)陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS進(jìn)行K19-JCVT抗原質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用Western blot方法檢測(cè)JCVT抗原的表達(dá)情況。結(jié)果K19-JCVT抗原表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建，AGS胃癌細(xì)胞系高表達(dá)細(xì)胞角蛋白19并用于K19-JCVT抗原表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染K19-T抗原質(zhì)粒的AGS細(xì)胞系有T抗原表達(dá)。結(jié)論 同義突變和相似連接在質(zhì)粒構(gòu)建中起到關(guān)鍵作用，酶切位點(diǎn)的甲基化也是值得注意的問(wèn)題。

JC病毒；T抗原；真核表達(dá)；載體構(gòu)建

JC病毒（John Cunningham virus，JCV）是多瘤病毒家族成員之一，人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其與惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切［1～4］。本研究小組成員利用巢式PCR和Southern雜交方法檢測(cè)JCV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌中存在JCVT抗原基因，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果表明胃癌中JCV拷貝數(shù)顯著高于正常胃黏膜，原位PCR證實(shí)JCVT抗原存在于胃癌細(xì)胞核中，提示JCVT抗原可能參與胃黏膜上皮細(xì)胞惡變［5］。日本學(xué)者利用胃黏膜上皮細(xì)胞中高活性的角蛋白19（keratin 19，K19）啟動(dòng)子成功建立了胃癌轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，為胃癌研究人員提供了方便快捷的胃腫瘤動(dòng)物模型［6］。本研究通過(guò)構(gòu)建能夠在含K19啟動(dòng)子的胃黏膜中特異表達(dá)的JCV抗原表達(dá)質(zhì)粒，為轉(zhuǎn)基因小鼠及胃癌動(dòng)物模型的建立提供穩(wěn)定、可靠的分子工具。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建pBSK-T抗原質(zhì)粒

設(shè)計(jì)引物 P1和 P4、P2和 P3，以 pBSK-JCVmad1質(zhì)粒為模板選用具有高保真性能的pfu DNA polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)同義突變，將NdeⅠ的酶切位點(diǎn)CCATATGCA突變成SplⅠ酶切位點(diǎn)CCGTACGCA。其中脯氨酸CCA同義突變成脯氨酸CCG，酪氨酸TAT同義突變成酪氨酸TAC。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3min；94℃ 45s，65℃ 45s，72℃ 60s，共30個(gè)循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物用BKL試劑盒進(jìn)行磷酸化，通過(guò)HincⅡ位點(diǎn)酶切并去磷酸化后與pBSK質(zhì)粒連接，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pBSK-P1-P4和pBSK-P2-P3。然后將pBSK-P1-P4和pBSK-P2-P3分別用XhoⅠ和SplⅠ進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建pBSK-T抗原質(zhì)粒。用HincⅡ/HindⅢ對(duì)連接的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定（圖1）。

1.2 構(gòu)建K19-JCVT抗原表達(dá)質(zhì)粒

將pBSK-T抗原質(zhì)粒先用scs110進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后擴(kuò)增及純化，再用BclⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。將Cox2片段用BamHⅠ從K19-Cox2質(zhì)粒切下來(lái)，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收余下的K19載體。由于BclⅠ和BamHⅠ有相同的黏末端，所以酶切后可進(jìn)行連接，構(gòu)建質(zhì)粒K19-T抗原。NdeⅠ和BamHⅠ酶切鑒定重組體，測(cè)序鑒定T抗原基因插入的方向及DNA序列，插入方向正確的重組體記為K19-T抗原質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃、5%CO2和含10%胎牛血清培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系，MKN28（高分化腺癌）、MKN45（低分化腺癌）和KATO-Ⅲ（印戒細(xì)胞癌）在RPMI1640培養(yǎng)液里進(jìn)行培養(yǎng)，HGC-27（未分化腺癌）在MEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，而AGS（中分化腺癌）在Ham F12培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 免疫組化

所有細(xì)胞離心收集并用PBS緩沖液洗后固定在10%的福爾馬林中，常規(guī)方法制作成石蠟標(biāo)本，并切成4μm切片。石蠟切片脫蠟至水化并用TRS（DAKO，Carpinteria CA93013，USA）進(jìn)行抗原修復(fù)，5%胎牛血清封閉5min阻斷非特異性結(jié)合，抗人-細(xì)胞角蛋白 19一抗（Neomarker；1∶100）孵育 15min，抗鼠IgG-HRP二抗孵育（DAKO，即用型）15min，最后進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染和封片，孵育和DAB顯色在間歇微波照射中進(jìn)行，孵育后用TBST洗去非特異性結(jié)合，去除一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡雜交

篩選細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19）表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行K19-T抗原轉(zhuǎn)染。依據(jù)Effectene（QIAGEN）產(chǎn)品說(shuō)明，將K19-JCVT抗原表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AGS胃癌細(xì)胞系中，pEGFP-N1作為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)轉(zhuǎn)染體系。利用RIPA裂解液［50mmol/LTris-HCl（pH7.5），150mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA，0.5%Nonidet P-40，5mmol/Ldithiothreitol，10mmol/LNaF，protease inhibitor cocktail（Sigma）］和超聲粉碎提取細(xì)胞總蛋白。利用BCA試劑盒（Pierce）蛋白定量后取100μg蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到Hybond膜（Amersham）上，用5%脫脂奶粉/0.1%Tween20/TBS（TTBS）室溫封閉膜 1h，一抗用兔SV40T抗原（抗SV40T抗原抗體與JCVT抗原可交叉反應(yīng)；Santa Cruz；1∶500） 孵育 1h，TTBS洗3次，加入辣根酶標(biāo)記的羊抗兔-IgG（DAKO；1∶1000）于室溫孵育 1h，ECL顯色（Santa Cruz），富士LAS2000檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 pBSK-T抗原質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

JCVT抗原PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，磷酸化后插入pBSK的多克隆位點(diǎn)。通過(guò)XhoⅠ和SplⅠ進(jìn)行雙酶切將分割JCVT抗原連接，突變NdeⅠ為SplⅠ，兩端加入BclⅠ位點(diǎn)。用HincII/HindIII雙酶切pBSK-JCVT抗原質(zhì)粒，所得3條DNA片段符合預(yù)期片段（圖2），測(cè)序鑒定了插入基因的正確性。

2.2 K19-T抗原質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建的pBSK-JCVT抗原質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SCS110感受態(tài)細(xì)胞后，提取DNA并進(jìn)行BclⅠ酶切，與K19-COX-2質(zhì)粒BamHⅠ酶切片斷連接，利用NdeⅠ和BamHⅠ酶切鑒定。構(gòu)建的K19-T抗原質(zhì)粒用NdeⅠ酶切電泳，可見(jiàn)到2條DNA條帶，用BamHⅠ酶切電泳，可見(jiàn)到1條DNA條帶，利用兩酶聯(lián)合切割，可得到3條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。設(shè)計(jì)引物后，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)和JCVT抗原兩端序列完全正確（圖4）。

2.3 細(xì)胞角蛋白19蛋白表達(dá)篩選及K19-JCVT抗原表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)

細(xì)胞角蛋白 19在 AGS、MKN28、MKN45、KATOⅢ、HGC-27細(xì)胞系中都是陽(yáng)性表達(dá)（圖5）。細(xì)胞角蛋白19的啟動(dòng)子是K19，所以細(xì)胞角蛋白19陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞可以激活K19啟動(dòng)子。以pEGFP-N1為內(nèi)參將K19-T抗原表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞系。Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中存在大T抗原（分子量為94kDa）的表達(dá)，而對(duì)照組中未出現(xiàn)（圖5）。

3 討論

JC病毒（還包括SV40和BK病毒）基因組為環(huán)狀閉合雙鏈DNA（約5.2kb），含有T抗原、VP和agnoprotein3個(gè)主要基因。T抗原為早期編碼基因，通過(guò)選擇性剪接可形成大T和小t抗原。大T抗原具有ATP酶、解旋酶和聚合酶活性，在病毒基因組復(fù)制中發(fā)揮重要作用。agnoprotein為一個(gè)小調(diào)節(jié)蛋白編碼基因［1，2］。

JCV中起關(guān)鍵致癌作用的大T抗原可與抑癌基因pRb和p53編碼蛋白結(jié)合而使其喪失對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)節(jié)，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)而促進(jìn)β-鏈接素核移動(dòng)和癌基因c-myc蛋白表達(dá)，可上調(diào)胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）和胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體（insulin-like growth factor-1receptors，IGF-1R）表達(dá)及磷酸化來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過(guò)與AP-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而擾亂正常細(xì)胞生命活動(dòng)［3～5］?？傊?，T抗原在JCV致癌的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

由于K19-Cox-2質(zhì)粒啟動(dòng)子兩側(cè)有NdeⅠ酶切位點(diǎn)，所以設(shè)計(jì)PCR引物的時(shí)候，將T抗原中的脯氨酸CCA同義突變成脯氨酸CCG，酪氨酸TAT同義突變成酪氨酸TAC，進(jìn)而將NdeⅠ酶切位點(diǎn)突變成BclⅠ。然后可以在構(gòu)建好的pBSK-T抗原質(zhì)粒中利用BclⅠ酶切下T抗原后插入K19質(zhì)粒中。

SCS110是endA-衍生的JM110菌株。SCS110為質(zhì)?；蚴删wDNA的制備提供理想場(chǎng)所，使質(zhì)?；蚴删wDNA免于Dam或者Dcm甲基化，因此1個(gè)或多個(gè)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶可以切割DNA［7］。實(shí)驗(yàn)中使用的BclⅠ是甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建的pBSK-T抗原質(zhì)粒在用SCS110轉(zhuǎn)化后，可以被BclⅠ酶切下來(lái)，進(jìn)而可以繼續(xù)下一步連接反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)用DH5α對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但是擴(kuò)增的質(zhì)粒無(wú)法用BclⅠ進(jìn)行切割及連接。

本實(shí)驗(yàn)選用的Stratagene的Pfu酶是一種熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，從攜帶Pyrococcus furiosus的pol基因的大腸桿菌中分離得到［8，9］。該酶具有 3′到 5′校讀外切酶活性，催化DNA合成，并且錯(cuò)誤率極低。Pfu是目前已發(fā)現(xiàn)的所有聚合酶里面保真度最高的聚合酶。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中曾經(jīng)使用其他的DNA聚合酶，都沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果。

建立在胃組織特異細(xì)胞中表達(dá)的JCVT抗原基因真核表達(dá)載體，將為轉(zhuǎn)基因小鼠及胃癌動(dòng)物模型的建立提供穩(wěn)定、可靠的分子工具。胃癌是消化道惡性腫瘤中最多見(jiàn)的癌種，死亡率居惡性腫瘤之首位，建立胃癌腫瘤動(dòng)物模型可為胃癌的早期診斷、治療和發(fā)病機(jī)制的研究提供非常有用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

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（編輯 武玉欣，英文編輯 鄭華川）

The Construction and Expression Confirmation of JCVirus TAntigen Expression Plasmid in Gastric Mucosa

XIAPu1，XUXiao-yan2，JIABao-ping3，WANGWei2，GUANYi-fu1，TAKANOYasuo4，ZHENGHua-chuan1
（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology；2.Department of Pathopysiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.The Archives，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Department of Diagnostic Pathology，School of Medicine，U－niversity of Toyama，Sugitani 930-0194，Japan）

ObjectiveTo construct and confirm the JCvirus（JCV）Tantigen expression plasmid using mouse keratin 19（K19）promoter specific for the gastric epithelial cells.MethodsThe NdeIsite was mutated by PCRwith BclIinsertion at both sides.The DNAfragment digested by BclⅠ was ligated with the plasmid containing K19promoter via BamⅠ site.The DNAsequence was confirmed by restriction enzyme digestion and direct DNAsequencing.Cytokeratin 19protein was examined to screen gastric carcinoma cell for transfection of K19-JCVTantigen expression plasmid by immunohistochemistry.The Western blot was employed to detect the JCVTantigen expression in the gastric carcinoma transfectant.ResultsK19-JCVTantigen expressing plasmid was successfully constructed.The AGSstrongly expressed cytokeratin 19protein and was selected for the transfection of K19-JCVTantigen expressing plasmid.JCVTantigen was positively expressed in the AGStransfectant.ConclusionThe synonymous mutation and compatible ligation are useful in the plasmid construction.The methylation of restriction enzyme should be considered.It is meaning for the transgenic animal model of gastric carcinoma to successfully construct the JCvirus Tantigen expression plasmid in gastric mucosa.

JCvirus；Tantigen；eukaryotic expression；vector construction

R731

A

0258-4646（2010）01-0018-04

沈陽(yáng)人才資源開(kāi)發(fā)基金項(xiàng)目；遼寧省百千萬(wàn)人才工程資助項(xiàng)目；教育部歸國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目；人事部留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目；2009年沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃資助項(xiàng)目（1091175-1-00）

夏蒲（1982-）男，碩士研究生.

鄭華川，E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2009-05-22