黃海能，羅起勝，趙邦，譚源福，鄧元央，黃華東，符黃德，李傳玉

（1.廣西右江民族醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 百色 533000；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021）

兔腦創(chuàng)傷后早期血清β淀粉樣前體蛋白動態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)研究

黃海能1，羅起勝1，趙邦1，譚源福2，鄧元央1，黃華東1，符黃德1，李傳玉1

（1.廣西右江民族醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 百色 533000；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021）

目的 探討兔腦創(chuàng)傷后血清β淀粉樣前體蛋白（β-APP）含量與損傷程度及其時間動態(tài)變化相關(guān)性。方法 將24只大白兔隨機(jī)分為對照組和輕、中、重度腦損傷組，各組于不同時間點(diǎn)（0.5h、2h、6h、24h）采集標(biāo)本，檢測血清β-APP的含量。結(jié)果采用完全隨機(jī)設(shè)計多因素重復(fù)測量方差分析和組間兩兩比較的LSD檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 腦損傷后血清β-APP均升高。中、重度損傷組各時間點(diǎn)血清β-APP含量較對照組和輕度損傷組升高（P＜0.05），重度損傷組血清β-APP含量各時間點(diǎn)均高于同時間點(diǎn)的中度損傷組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；輕度損傷組血清β-APP含量與對照組相比在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論 腦損傷后血清β-APP含量升高，且損傷越重血清β-APP含量越高。血清β-APP含量可作為早期判斷顱腦損傷程度指標(biāo)之一。

創(chuàng)傷性腦損傷；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法；β淀粉樣前體蛋白

近年來，對創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）神經(jīng)生化標(biāo)志物的研究已引起許多研究者的注意，其中β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）是新近受到較多關(guān)注的腦損害特異性血清標(biāo)記物，研究β-APP在不同損傷程度TBI后的變化，對繼續(xù)深入研究TBI后病理生理變化及預(yù)測損傷后神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)情況具有重要意義。本研究以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對象，檢測不同腦損傷程度兔血清β-APP含量的變化，初步探討兔腦創(chuàng)傷后血清β-APP含量與損傷程度的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量1.8～2.2㎏，3～4月齡，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。β-APP檢測試劑盒（美國ADL公司生產(chǎn)）；多導(dǎo)生理監(jiān)護(hù)儀MP100（美國CSI公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)參照霍永強(qiáng)等［1］建立的自由落體兔腦損傷模型。將大白兔隨機(jī)分為對照組（6只，暴露腦組織，但不進(jìn)行自由落體撞擊）及輕、中、重度損傷組（每組6只，各組均承受不同力量的落體撞擊），共4組。麻醉死亡動物不納入統(tǒng)計。各損傷組分別于傷后0.5h、2h、6h、24h 4個時間點(diǎn)抽取外周靜脈血2ml。對照組于針刺后肢疼痛反射恢復(fù)后0.5h、2h、6h、24h 4個時間點(diǎn)抽取血標(biāo)本，4℃、3000r/min離心15min，分離血清-70℃下保存待測。血清β-APP濃度測定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對照組、輕、中及重度損傷組組間比較

中、重度損傷組β-APP含量明顯高于輕度損傷組及對照組，具有顯著性差異（P＜0.05）；重度損傷組β-APP含量各時間點(diǎn)均高于同時間點(diǎn)的中度損傷組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；輕度損傷組各時間點(diǎn)β-APP含量與同時間點(diǎn)的對照組無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 時間點(diǎn)比較

傷后0.5h組、2h組與6h和24h組β-APP含量比較有顯著性差異（P＜0.05），且6h組和24h組比較差異亦有顯著性（P＜0.05），其余均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.3 各組組內(nèi)各時間點(diǎn)比較

中度組0.5h和2h與24h β-APP含量比較差異有顯著性（P＜0.05），而重度組只有0.5h和24h比較有顯著性差異（P＜0.05），其余均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1大白兔不同腦損傷程度β-APP含量隨時間的變化（±s，p g/mg）Ta b.1Th e r e l a t i o n s h i p o f s e r u mβ-APPl e v e l s w i t h d e g r e e o f t r a u ma t i c b r a i n i n j u r y a n d t h e v a r i a n c e o f t i me（±s，p g/mg）Group 0.5h 2h 6h 24h Normal control 310.52±128.74 370.69±63.17 363.08±127.35 402.55±23.34Slight injury 429.95±42.77 332.60±58.15 387.15±36.65 432.22±153.6Moderate injury 451.62±54.09 514.06±130.57 616.91±194.27 729.91±128.25Serere injury 498.69±34.35 609.90±257.58 700.07±173.62 780.41±161.48

3 討論

β-APP是一種具有受體樣結(jié)構(gòu)的大分子跨膜糖蛋白，由高爾基體產(chǎn)生并由軸突的快速軸漿運(yùn)輸通道運(yùn)輸，正常情況下廣泛表達(dá)于大多數(shù)細(xì)胞，以神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中含量較豐富。β-APP先后經(jīng)β-分泌酶（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE1）和γ-分泌酶剪切生成β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）多肽，BACE1是腦內(nèi) Aβ形成的關(guān)鍵酶。病理?xiàng)l件下，腦內(nèi)的BACE1蛋白含量及其酶活性升高，細(xì)胞內(nèi)Aβ的生成量增加從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)［2］，在腫脹的軸突中可見β-APP陽性反應(yīng)，且頭部損傷后β-APP陽性的軸索部位表現(xiàn)為彌漫性軸索損傷中所描述的軸突回縮球，提示軸索β-APP的免疫反應(yīng)性可能代表了軸突損傷。外傷性腦損傷導(dǎo)致的細(xì)胞骨架崩解，細(xì)胞軸漿流動停止是β-APP在軸突積聚的一個重要原因［3］，所以多數(shù)學(xué)者認(rèn)為 APP是軸突損傷和斷裂的標(biāo)志物?？梢酝茰yβ-APP含量變化與腦創(chuàng)傷程度存在著密切的相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷組0.5h內(nèi)血清β-APP含量就出現(xiàn)增高，并呈上升趨勢；中、重度腦損傷組升高幅度顯著增大，其血清β-APP含量明顯高于輕度腦損傷組及對照組。提示，腦創(chuàng)傷后可引起血清β-APP含量增高，創(chuàng)傷越重，血清β-APP含量越高，且與損傷程度呈正相關(guān)。此結(jié)果表明，腦創(chuàng)傷后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞損害，軸索扭曲、腫脹、斷裂，細(xì)胞骨架崩解，軸漿外溢，血-腦屏障破壞或功能障礙，血-腦屏障的通透性增加，β-APP進(jìn)入血液循環(huán)［4］。腦創(chuàng)傷越重，對神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)纖維、星形膠質(zhì)細(xì)胞的破壞越明顯，影響范圍更廣泛，同時，腦損傷后損傷部位的缺血及炎癥和免疫反應(yīng)可導(dǎo)致血-腦屏障進(jìn)一步破壞，使其毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙增寬，血管壁連接松散，血-腦屏障的通透性增加；β-APP可以通過血-腦屏障大量釋放到血液循環(huán)中［5］。

本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重度損傷組β-APP含量各時間點(diǎn)均高于同時間的中度損傷組，但差異無顯著性（P＞0.05），這種改變的原因尚不清楚，考慮主要是由于所采用外傷模型以及損傷程度不同造成的，但大致的變化趨勢還是一致的。輕度損傷組各時間點(diǎn)β-APP含量與同時間的對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），提示損傷程度較輕，范圍較小，腦組織及血-腦屏障破壞或功能障礙不明顯，同時也可能與機(jī)體本身作用影響有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，兔腦損傷后0.5h組、2h組與6h組和24h組比較差異有顯著性（P＜0.05），6h組和24h組比較也有顯著性差異（P＜0.05）；各組組內(nèi)各時間點(diǎn)血清β-APP含量比較顯示，中度損傷組0.5h、2h與24h比較差異有顯著性（P＜0.05），而重度損傷組0.5h和24h比較有顯著性差異（P＜0.05）。此結(jié)果提示，兔腦損傷后隨著時間的延長，β-APP含量不斷增多，6h時逐漸明顯，24h時最明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，早在傷后0.5h，β-APP蛋白表達(dá)就開始增加，之后持續(xù)增強(qiáng)，于傷后26h強(qiáng)度減弱，增高的時間與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。其原因可能是β-APP含量的變化還受到損傷后多種因素的繼發(fā)影響，β-APP的表達(dá)可因細(xì)胞應(yīng)激和缺氧等損害而增強(qiáng)，β-APP過度表達(dá)刺激Aβ生成途徑，造成Aβ的積聚，后者除對細(xì)胞具有直接毒性外，還可增強(qiáng)或放大低糖、興奮性毒性、自由基等細(xì)胞損傷效應(yīng)［6］，而β-APP對神經(jīng)系統(tǒng)損傷有高度敏感性，神經(jīng)元的損傷會導(dǎo)致β-APP免疫反應(yīng)活性的增加，各因素的共同作用導(dǎo)致形成惡性循環(huán)，這些因素的繼發(fā)影響在6h時逐漸明顯，24h時尤為嚴(yán)重。

總之，本研究表明腦創(chuàng)傷后可引起血清β-APP含量增高，并與損傷程度呈正相關(guān)，創(chuàng)傷越重，含量越高，隨著時間的延長，β-APP含量不斷增高。早期檢測血清β-APP含量對于腦損傷程度的評判是有一定價值，可以作為診斷評判腦損傷程度的參考指標(biāo)之一。

［1］霍永強(qiáng)，譚源福.一種改進(jìn)的落體腦創(chuàng)傷模型［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，24（2）：217-219.

［2］Hayashi T，Ago K，Ago M，et al.Two patterns of beta-amyloid precursor protein（APP）immunoreactivity in cases of blunt head injury［J］.Leg Med（Tokyo）.2009，11（Suppl 1）：S171-S173.

［3］Leclercq PD，Stephenson MS，Murray LS，et al.Simple morphometry of Axonal swellings cannot be used in isolation for dating lesions after traumatic brain injury ［J］.JNeurotrauma，2002，19（10）：1183-1192.

［4］Hortobágyi T，Wise S，Hunt N，et al.Traumatic axonal damage in the brain can be detected using beta-APPimmunohistochemistry within 35min after head injury to human adults［J］.Neuropathol Appl Neurobiol.2007，33（2）：226-237.

［5］Itoh T，Satou T，Nishida S，et al.Expression of amyloid precursor protein after rat traumatic brain injury ［J］.Neurol Res.2009，31（1）：103-109.

［6］Campard PK，Tasiaux B，Octave JN.The processing and biological function of the human amyloid precursor protein（APP）：lessons from different cellular models［J］.Exp Gerontol，2000，35（6-7）：843-850.

（編輯 裘孝琦，英文編輯 鄭華川）

The Dynamical Changes of Serum β-APPin Early Stage of Rabbit Traumatic Brain Injury

HUANGHai-neng1，LUOQi-sheng1，ZHAOBang1，TANYuan-fu2，DENGYuan-yang1，HUANGHua-dong1，F(xiàn)UHuang-de1，LIChuan-yu1

（1.Department of Neurosurgery，The Affiliated Hospital，Guangxi Youjiang Medical College，Baise 533000，China；2.Department of Neurosurgery，The Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

ObjectiveTo explore the relationship of serum levels of β-amyloid precursor protein （β-APP）with degree of traumatic brain injury （TBI）and the traumatic time.MethodsSprague-Dawley （SD）rats were randomly divided into normal control and injury group.The rats in injury groups suffered from TBIafter free-falling percussion with different pressure（wild-injury，moderate-injury and severe-injury group）.Then serum was collected at 0.5h，2h，6h，and 24h and subject to β-APPdetection by ELISA.All data were analyzed statistically with completely randomized design multiple factor repeated measure of variance analysis and least significant difference（LSD）test.ResultsThe serum levels of β-APPwere higher after injury.The serum levels of β-APPwere significantly higher in moderate-injury or severe-injury group than those in normal group or slight-injury group（P<0.05）.The serum levels of β-APPwere higher in severe-injury group than that in moderate-injury group with no statistical difference （P>0.05）.There was no statistical difference in serum β-APPlevels between normal control and slight-injury group （P>0.05）.ConclusionThe serum level of β-APPis increasingly higher with traumatic brain injury more serious and could be employed as an indicator of TBIdegree.It implies that β-APPhas the potential as an early diagnosis marker for TBI.

traumatic brain injury；enzyme linked immunosorbent assay；β-amyloid precursor protein

R446.1

A

0258-4646（2010）01-0022-02

廣西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（0663030）

黃海能（1968-），男，副主任醫(yī)師，副教授.E-mail：hnhuang@126.com

2009-04-12