張依寧，魏敏杰，孫明軍

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡科；2.藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 110001）

伊立替康抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和ATP敏感性鉀通道的相關(guān)性研究

張依寧1，魏敏杰2，孫明軍1

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡科；2.藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 110001）

目的 檢測腫瘤化療藥物伊立替康（CPT-11）對人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞和HT-29細(xì)胞的作用，并探討可能機制。方法 用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖；用Transwell法檢測細(xì)胞侵襲力；用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；用流式細(xì)胞術(shù)PI單染法檢測細(xì)胞周期；用膜片鉗方法檢測ATP敏感性鉀電流（IKATP），并比較藥物對兩種細(xì)胞作用的異同。結(jié)果 1.0～64.0μg/ml的CPT-11呈劑量依賴性和時間依賴性抑制HCT-116和HT-29的增殖，CPT-11抑制HCT-116和HT-29細(xì)胞增殖作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為39.3和19.5μg/ml；近似IC50濃度的CPT-11作用48h可使HCT-116和HT-29細(xì)胞阻滯于G0/G1期及S期，其中G0/G1期及S期比例分別從27.4%和17.4%上升至95.9%和98.2%，該濃度的CPT-11作用48h還可誘導(dǎo)HCT-116和HT-29細(xì)胞凋亡，凋亡率分別從14.8%和9.3%上升到36.9%和27.9%。CPT-11對HCT-116和HT-29細(xì)胞的侵襲抑制率分別為40.8%和47.5%。CPT-11可劑量依賴性的降低HCT-116和HT-29細(xì)胞膜IKATP水平。結(jié)論 CPT-11能有效抑制人結(jié)直腸癌HCT-116和HT-29細(xì)胞增殖和侵襲力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且對HT-29細(xì)胞的作用較強；CPT-11抑制細(xì)胞增殖作用與其抑制細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道開放相關(guān)。

伊立替康；HCT-116細(xì)胞；HT-29細(xì)胞；細(xì)胞增殖

伊立替康（irinotecan，CPT-11）是喜樹堿的半合成物，是特異性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑［1］，應(yīng)用于多種腫瘤治療，也是較早應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的藥物。由于其抗腫瘤作用與ATP敏感性鉀通道的相關(guān)性研究尚未見報道，故本實驗在研究CPT-11對人結(jié)直腸癌HCT-116和HT-29細(xì)胞增殖作用的同時，檢測了對細(xì)胞膜ATP敏感性鉀電流（IKATP）的影響，旨在探討CPT-11抗大腸癌細(xì)胞增殖作用與ATP敏感性鉀通道及IKATP的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CPT-11，購自江蘇恒瑞制藥公司，用0.9%無菌生理鹽水配成所需濃度；格列本脲、四氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、RNase A均購自 Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；RPMI1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco BRL公司；Annexin v-FITC/PI雙染凋亡試劑盒，購自晶美生物工程有限公司；Transwell，購自美國Corning公司；流式細(xì)胞儀，美國BDFASCSCalibur公司產(chǎn)品；垂直電極拉制器（Narishige PC-10，日本）；膜片鉗（Axon Instrument 700B）。

1.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞株

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116和HT-29，由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供。用含10%標(biāo)準(zhǔn)FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.3 溶液

電極外液：NaCl 143mmol/L，KCl 5.4mmol/L，CaCl21.8mmol/L，MgCl20.5mmol/L，NaH2PO40.3mmol/L，HEPES5mmol/L，NaOH2.3mmol/L，葡萄糖5mmol/L，用1mmol/LNaOH將pH值調(diào)至7.4。電極內(nèi)液：NaCl 143mmol/L，KCl 5.4mmol/L，MgCl20.5mmol/L，Na2ATP0.3mmol/L，EGTA5.0mmol/L，用 1mmol/LNaOH將pH值調(diào)至7.4。

1.4 MTT法檢測藥物抑制HCT-116和HT-29細(xì)胞增殖的作用

1.4.1 給藥濃度：參照文獻(xiàn)［2］的方法設(shè)立CPT-11不同濃度處理組，CPT-11作用HCT-116和HT-29細(xì)胞的終濃度分別為 1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0和64.0μg/ml；設(shè)立陰性對照組（無菌生理鹽水）。

1.4.2 MTT檢測：將對數(shù)生長期的細(xì)胞分別進(jìn)行處理并繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，向各孔加入5mg/ml的 MTT20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄板內(nèi)液體，然后每孔加入150μl DMSO，60r/min振蕩10min，用酶標(biāo)儀 570nm 檢測光密度（optical density，OD）值，實驗重復(fù)3次，計算生長抑制率（%）=（對照孔OD均值-實驗孔OD均值）/對照孔OD均值×100。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)PI單染法檢測細(xì)胞周期

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，根據(jù)兩株細(xì)胞對藥物的反應(yīng)，確定兩株細(xì)胞單一劑量用藥的濃度 HCT-116為 32.0μg/ml，HT-29為 16.0μg/ml，作用48h后收集細(xì)胞，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，1000r/min，4℃，離心 10min，棄上清，加入 1ml冰冷的PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，重復(fù)以上步驟2次，用100g/ml濃度的RNase-A和100g/ml濃度的PI溶液各500μl重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 Transwell法檢測藥物對HCT-116和HT-29細(xì)胞侵襲力的影響

將無血清的RPMI1640與Matrigel基質(zhì)膠按照8∶1混合，向 Transwell板的每個小室鋪 100μl該混合液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h。將100μl濃度為2.5×105/ml的細(xì)胞懸液加入Transwell板的上室，并同時給藥處理，下室中加入500μl含有20%血清的培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育指定時間，取出Transwell用PBS清洗，擦去基質(zhì)膠和上室細(xì)胞，PBS清洗3次，甲醇固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，PBS清洗3次，自然風(fēng)干后在顯微鏡下觀察照相。計數(shù)侵入濾膜的細(xì)胞數(shù)，共計數(shù)中央和四周各5個視野（×200），取平均值。實驗重復(fù)3次，藥物對細(xì)胞侵襲力的抑制率（%）＝（用藥前侵入濾膜細(xì)胞數(shù)均值－用藥后侵入濾膜細(xì)胞數(shù)均值）/用藥前侵入濾膜細(xì)胞數(shù)均值×100。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測藥物對HT-29細(xì)胞凋亡的影響

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整至1×106/ml，貼壁后進(jìn)行藥物處理。作用指定時間后收集細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞消化，取1ml細(xì)胞，1000r/min，4℃，離心10min，棄上清，加入1ml冰冷的PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，重復(fù)以上步驟2次，將細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液中，加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI，輕輕混勻，37℃避光反應(yīng)15min。最后加入300μl結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，1h之內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.8 膜片鉗技術(shù)記錄全細(xì)胞模式下IKATP的變化

將玻璃電極輕壓在細(xì)胞表面，進(jìn)行千兆封接，當(dāng)形成全細(xì)胞狀態(tài)后用Pclamp 10.0程序記錄細(xì)胞膜離子電流的變化。IKATP的電壓鉗制方案：設(shè)保持電位-40mV，刺激電位為-100mV～+50mV，步階脈沖10mV，波寬300ms，刺激間隔6s。應(yīng)用K+ATP通道特異性拮抗劑格列本脲證實所引電流為IKATP，應(yīng)用不同濃度CPT-11處理細(xì)胞，監(jiān)測IKATP的變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Pclamp10.0程序中的Clampfit軟件進(jìn)行膜片鉗電流大小的測量和分析，結(jié)果用±s表示。數(shù)據(jù)處理使用SPSS13.0軟件包完成；組間比較用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPT-11抑制HCT-116和HT-29細(xì)胞增殖

1.0～64.0μg/ml的 CPT-11作用 HCT-116細(xì)胞和HT-29細(xì)胞48h時，均呈劑量依賴性抑制細(xì)胞增殖作用，半數(shù)抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50） 分別為 39.3和 19.5μg/ml，CPT-11抑制 HT-29細(xì)胞增殖作用強于抑制HCT-116細(xì)胞增殖作用（P<0.05）。見圖 1。

2.2 CPT-11對HCT-116和HT-29細(xì)胞周期的影響應(yīng)用 32.0μg/ml和 16.0μg/ml的 CPT-11分別

處理HCT-116和HT-29細(xì)胞48h，均可抑制細(xì)胞由G0/G1期及S期向G2/M期的過渡（P<0.05），從而將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期及S期，抑制細(xì)胞的增殖。對兩株細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HT-29比HCT-116對藥物的反應(yīng)更加敏感，較低藥物濃度即對HT-29細(xì)胞有較強的抑制作用。見表1。

表1CPT-11對HCT-116、HT-29細(xì)胞周期的作用（x±s，%）Ta b.1Th e e f f e c t o f CPT-11o n t h e c e l l c y c l e（x±s，%）Cell cycle HCT-116 HT-29Control CPT-11group Control CPT-11group G0/G1 8.10±2.43 52.18±5.641） 5.88±3.15 96.31±4.131）S19.30±5.12 43.76±5.871） 11.51±7.01 1.86±6.701）G2/M 72.60±6.76 5.06±1.121） 82.61±5.36 1.83±2.401）1）P<0.05，compared with control.

2.3 CPT-11對HCT-116和HT-29細(xì)胞侵襲力的影響

應(yīng)用 32μg/ml和 16μg/ml的 CPT-11分別處理HCT-116與HT-29細(xì)胞24h和48h，細(xì)胞侵襲力均被抑制，且存在時間依賴性。見表2。

表2CPT-11對HCT-116、HT-29細(xì)胞侵襲力的抑制作用（±s）Ta b.2Th e i n h i b i t i n g e f f e c t o f CPT-11o n c e l l i n v a s i v e n e s s（±s）HCT-116 HT-29Invasive cell Inhibiting rate（%） Invasive cell Inhibiting rate（%）0h 443.4±78.9 0 551.1±105.3 024h 115.7±21.5 26.1±5.11） 156.5±33.3 28.4±6.21）48h 267.4±35.7 40.8±6.51），2） 289.3±45.8 47.5±7.81），2）Time point 1）P<0.05，compared with 0h；2）P<0.05，compared with 24h.

2.4 CPT-11對HCT-116和HT-29細(xì)胞凋亡的影響

應(yīng)用 32μg/ml和 16μg/ml的 CPT-11分別處理人結(jié)直腸癌HCT-116和HT-29細(xì)胞24h和48h后，均能促進(jìn)兩株細(xì)胞的凋亡，其中以晚期凋亡作用（UR）明顯（P<0.05），并具有時間依賴性。見表3。

表3CPT-11對HCT-116、HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用（±s）Ta b.3CPT-11i n d u c e d t h e a p o p t o s i s o f HCT-116a n d HT-29（±s）Time point HCT-116 HT-29UR（%） LR（%） UR（%） LR（%）0h 4.24±1.37 10.57±2.10 7.19±1.15 2.12±0.2924h 11.21±1.121） 12.25±2.12 12.51±2.151） 4.27±1.1248h 19.09±3.071），2） 17.90±4.531） 21.54±5.571），2） 6.38±1.921）UR，up right quadrant，necrosis+delayed apoptosis；LR，low right quadrant，apoptosis.1）P<0.05，compared with 0h；2）P<0.05，compared with 24h.

2.5 CPT-11對HCT-116和HT-29細(xì)胞膜IKATP的影響

刺激電位為-100mV～+50mV時，可以記錄到外向電流，該電流可被IKATP特異性拮抗劑50μmol/L格列本脲所抑制，說明所引出電流為細(xì)胞膜的IKATP。用 4.0，16.0和 64.0μg/ml的 CPT-11處理細(xì)胞，在同一指令電壓下記錄細(xì)胞膜IKATP變化，結(jié)果顯示隨著CPT-11濃度增加，IKATP可見劑量依賴性的減小，CPT-11作用引起的細(xì)胞膜上的IKATP變化與CPT-11的藥物濃度呈劑量依賴性負(fù)相關(guān)。見圖2。

3 討論

CPT-11在組織中羧酸脂酶的作用下生成活性代謝產(chǎn)物，SN-38是其最具活性的代謝產(chǎn)物之一，通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ而特異性抑制DNA鏈重組，引起DNA長鏈斷裂，從而使DNA的復(fù)制受阻、失衡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［3，4］。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用CPT-11處理48h后，HCT-116的細(xì)胞周期均發(fā)生改變，G2/M期細(xì)胞明顯減少，而G0/G1期及S期細(xì)胞增加，說明CPT-11能周期特異性地抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖。

細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道在腫瘤細(xì)胞生長中的作用是近來腫瘤研究的熱點之一［5～7］，但是關(guān)于在結(jié)直腸癌中CPT-11抗腫瘤作用與K+通道的相關(guān)性研究尚未見報道。腫瘤細(xì)胞的生物電特性不同于正常細(xì)胞，其細(xì)胞膜電位有去極化趨勢，而細(xì)胞膜去極化被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，而這與K+通道及K+電流密切相關(guān)。據(jù)報道，在前列腺癌及成神經(jīng)細(xì)胞瘤中，K+電流對細(xì)胞的增殖起著重要的調(diào)控作用［8］。細(xì)胞膜上的K+通道促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并且抑制K+通道功能或下調(diào)K+通道表達(dá)可抑制腫瘤發(fā)生，表明K+通道在腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程中的重要作用［9，10］。

本實驗應(yīng)用CPT-11作用人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116及HT-29，證實了CPT-11能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并進(jìn)一步應(yīng)用膜片鉗檢測CPT-11對HT-29與HCT-116細(xì)胞膜電流的影響，發(fā)現(xiàn)CPT-11對兩種細(xì)胞均具有較好的劑量依賴性負(fù)相關(guān)作用，通過應(yīng)用ATP敏感性鉀通道特異性拮抗劑格列本脲證明為ATP敏感性鉀通道。說明CPT-11對HCT-116及HT-29細(xì)胞的抑制作用可能與細(xì)胞膜上的ATP敏感性鉀通道的相關(guān)。但是否還有其他機制參與，或是否有其他亞型的鉀通道參與以及可能的調(diào)控機制，則有待于進(jìn)一步研究。

［1］Fuchs C，Mitchell EP，Hoff PM.Irinotecan in the treatment of colorectal cancer［J］.Cancer Treat Rev，2006，32（7）：491-503.

［2］高勇，劉揚清，易竹筠，等.伊力替康、奧沙利鉑及氟尿嘧啶對人大腸癌LoVo細(xì)胞株作用的實驗研究［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2008，13（3）：217-221.

［3］Ashley AC，Sargent DJ，Alberts SR，et al.Updated efficacy and toxicity analysis of irinotecan and oxaliplatin （IROX）：intergroup trial N9741in first-line treatment of metastatic colorectal cancer［J］.Cancer，2007，110（3）：670-677.

［4］Tiersten AD，Nelsen C，Talbot S，et al.Aphase IItrial of docetaxel and estramustine in patients with refractory metastatic breast carcinoma［J］.Cancer，2003，97（3）：537-544.

［5］Parihar AS，Coghlan MJ，Gopalakrishnan M，et al.Effects of intermediate-conductance Ca2+-activated K+channel modulators on human prostate cancer cell proliferation ［J］.Eur JPharmacol，2003，471（3）：157-164.

［6］Wang Z.Roles of K+channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis［J］.Pflugers Arch，2004，448（3）：274-286.

［7］Felipe A，Vicente R，Villalonga N，et al.Potassium channels：new targets in cancer therapy［J］.Cancer Detect Prev，2006，30（4）：375-385.

［8］Camacho J.Ether à go-go potassium channels and cancer［J］.Cancer Lett，2006，233（1）：1-9.

［9］Zhou Q，Kwan HY，Chan HC，et al.Blockage of voltage-gated K+channels inhibits adhesion and proliferation of hepatocarcinoma cells［J］.Int JMol Med，2003，11（2）：261-266.

［10］Preussat K，Beetz C，Schrey M，et al.Expression of voltage-gated potassium channels Kv1.3and Kv1.5in human gliomas［J］.Neurosci Lett，2003，346（1-2）：33-36.

（編輯 陳 姜，英文編輯 鄭華川）

The Correlation between the Inhibiting Effects of Irinotecan on Colorectal Cancer Cell Proliferation and ATP-sensitive Potassium Channel

ZHANGYi-ning1，WEIMin-jie2，SUNMing-jun1

（1.Department of Endoscopy，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pharmacology，College of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effects of Irinotecan （CPT-11）on human colorectal cancer HCT-116and HT-29cells and investigate the potential mechanisms.MethodsThe effect of Irinotecan on the proliferation of HCT-116and HT-29cells was determined by MTTassays.The invasive capacity was measured by transwell assays，and the apoptosis of the tumor cells was detected by flow cytometry after stained with Annexin-Vand PI.The difference between the current of ATP-sensitive potassium ion of HCT-116and HT-29was examined by patch clamp.ResultsIt was found that 1.0-64.0μg/ml CPT-11could inhibit the proliferation and the invasive capacity of HCT-116and HT-29cells at both dose-and time-dependent manner.The IC50of HCT-116and HT-29were 39.3and 19.5μg/ml respectively.Cytometry showed that the apoptotic rates were increased from 14.8%and 9.3%to 36.9%and 27.9%after the treatment of 32.0μg/ml and 16.0μg/ml CPT-11，which were close to their IC50.The proportion of G0/G1and Sof HCT-116and HT-29was enhanced from 27.4%and 17.4%to 95.9%and 98.2%.Transwell assay indicated that the invasiveness of HCT-116and HT-29was reduced by 40.8%and 47.5%.The patch clamp showed that CPT-11reduced the IKATPof cell membrane at a negative dose-dependent manner.ConclusionCPT-11could have a significant impact on the proliferation，invasiveness，cell cycle，and the apoptosis of human colorectal cancer cell HCT-116and HT-29.HT-29was more sensitive to CPT-11than HCT-116.The inhibitory effect of CPT-11on cell proliferation might be linked to its inhibition of ATP-sensitive potassium channel.

irinotecan；HCT-116cell；HT-29cell；cell proliferation

R735.3

A

0258-4646（2010）01-0010-04

遼寧省教育廳高?？蒲谢鹳Y助項目（2004D172）；遼寧省科技攻關(guān)項目（2007225017，2009225011-2）

張依寧（1982-），男，碩士研究生.

孫明軍，E-mail：smjmw@sina.com

2009-07-15