張銀亮,陳創(chuàng)夫,喬 軍,劉賢俠,王利曉,余勝利,胡朝輝

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 832003;2.新疆地方與民族高發(fā)病實(shí)驗(yàn)室,石河子 832003;3.新疆天康生物技術(shù)股份有限公司;4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)七師128團(tuán)奶牛場)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛最常見的產(chǎn)科疾病,主要病因是奶牛產(chǎn)犢后產(chǎn)道尚未恢復(fù)完全,牛場環(huán)境中致病菌較多,奶牛產(chǎn)后抵抗力較弱,病原菌趁機(jī)侵入產(chǎn)道,造成奶牛子宮內(nèi)膜等處產(chǎn)生炎癥。子宮內(nèi)膜炎對奶牛的生產(chǎn)性能有很大影響,如產(chǎn)奶量下降、人工授精次數(shù)增加、妊娠可能性和受孕率降低等,致使奶牛淘汰率增高,給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1],其中以臨床型子宮內(nèi)膜炎危害最為嚴(yán)重,它可使產(chǎn)后初配天數(shù)和受孕天數(shù)相應(yīng)增加29.81 d和50.67 d[2]。當(dāng)前,血液學(xué)研究已成為研究疾病病理發(fā)生發(fā)展的一種重要手段。本實(shí)驗(yàn)針對新疆烏魯木齊、昌吉、石河子、奎屯奶業(yè)較為發(fā)達(dá)地區(qū)的6個(gè)規(guī)模化奶牛場進(jìn)行子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定,并對其中19頭患子宮內(nèi)膜炎奶牛和8頭健康奶牛進(jìn)行血細(xì)胞成分分析測定,旨在明確引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌種類,并探討子宮內(nèi)膜炎患牛和健康牛血細(xì)胞成分的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及采樣材料 奶牛為引進(jìn)澳大利亞荷斯坦牛或中國荷斯坦牛,來源于新疆烏魯木齊、昌吉、石河子、奎屯6個(gè)規(guī)?；?根據(jù)直腸檢查和子宮分泌物的觀察,選取子宮內(nèi)膜炎患牛75頭和健康奶牛8頭,供采樣用。另選成年母兔8只、公兔1只用于配種(購于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。采樣材料為高錳酸鉀、新潔爾滅、酒精棉球、陰道開膣器、一次性無菌注射器、一次性輸精槍外鞘、滅菌棉簽、酒精燈、封口膜等。

1.2 培養(yǎng)基、染色劑及參考菌株 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖蛋白胨酵母提取物增菌培養(yǎng)基(PYG)、厭氧菌血瓊脂(CDC)、血瓊脂基礎(chǔ)、吐溫-80、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、伊紅美蘭瓊脂(EMB)、麥康凱瓊脂、芽孢染色液(購于杭州天和生物試劑有限公司)、革蘭氏染色液(按照文獻(xiàn)[3]配制)等。參考菌株無乳鏈球菌、停乳鏈球菌為本實(shí)驗(yàn)室保存,普通變形桿菌CMCC49027、金黃色葡萄球菌 ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希氏菌ATCC35218、化膿性鏈球菌ATCC19615、沙門氏菌CMCC50094、化膿性鏈球菌ATCC19615、蠟桿芽孢桿菌CNCC63301等均購于杭州天和生物試劑有限公司。

1.3 生化鑒定試劑 腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管(批號090507)、葡萄球菌屬細(xì)菌生化編碼鑒定管(批號090428)、鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管(批號090520)、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乙酰胺、甘露糖、精氨酸脫羧酶、D-核糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、肌醇、水楊素、木糖、山梨醇、衛(wèi)茅醇、肌醇、七葉苷、檸檬酸鹽、淀粉、明膠、紫牛乳(批號090601)靛基質(zhì)試劑、蛋白胨水、VP試驗(yàn)甲液、VP試驗(yàn)乙液、甲基紅(MR)試劑、葡萄糖磷酸鹽胨水、硝酸鹽還原試劑(甲)、硝酸鹽還原試劑(乙)、硝酸鹽(還原)(批號090506)等均購于杭州天和生物試劑有限公司。

1.4 細(xì)菌分離與鑒定

1.4.1 采樣 保定子宮內(nèi)膜炎患牛,先掏空直腸內(nèi)宿糞,然后用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗外陰,再用酒精棉球擦拭外陰,用滅菌開膣器打開陰道,由助手用一次性輸精槍外鞘沾取炎性分泌物并迅速投入營養(yǎng)肉湯和PYG液體培養(yǎng)基中,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。用一次性無菌注射器尾靜脈采血并在4 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.4.2 細(xì)菌分離 經(jīng)過24 h培養(yǎng)的菌液分別在營養(yǎng)瓊脂平板、CDC厭氧血平板、血平板、麥康凱平板、伊紅美蘭平板做四區(qū)劃線培養(yǎng)12～48 h,再根據(jù)菌落形態(tài)、溶血性、革蘭氏染色等特點(diǎn)挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng),后用終濃度為25%的甘油管-80℃保菌。

1.4.3 細(xì)菌鑒定 根據(jù)細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況和革蘭氏染色情況分為G+球菌、G-桿菌、G+桿菌、G-球菌4大類,以確定生化反應(yīng)項(xiàng)目[4]。G+球菌:鏡檢呈葡萄串狀且經(jīng)過氧化氫酶試驗(yàn)陽性者進(jìn)行葡萄球菌鑒定,鏡檢呈鏈狀且經(jīng)過氧化氫酶試驗(yàn)呈陰性者進(jìn)行鏈球菌鑒定;G-桿菌:乳糖試驗(yàn)陽性者,應(yīng)用腸桿菌科生化微量鑒定管進(jìn)行鑒定。乳糖試驗(yàn)陰性者,可根據(jù)菌落生長情況和 MR試驗(yàn)陰性者確定為銅綠假單胞菌,陽性者且遷徙生長為變形桿菌,歸于腸桿菌科;G+桿菌:根據(jù)其在普通平板上菌落形態(tài)呈蠟狀且通過芽孢染色可以看到芽孢初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌并進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng);G-球菌:未分離到。

1.4.4 細(xì)菌致病性實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[5]方法做改進(jìn),對所分離的細(xì)菌進(jìn)行致病性檢驗(yàn)。選擇成年健康母兔,利用自制的子宮灌注器吸取分離到的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌24 h培養(yǎng)物,按1∶1比例混合導(dǎo)入母兔子宮內(nèi),混合菌液分別接種模型組1:2只健康未孕母兔;模型組2:2只產(chǎn)后3 d母兔;模型組3:2只產(chǎn)后3 d并用韌物刺激產(chǎn)道的母兔;另取2只健康母兔做對照,用同樣方法在子宮內(nèi)注入滅菌肉湯。每3 d接種1次。每天10:00時(shí)和22:00時(shí)測量母兔體溫并觀察母兔陰道分泌物,待見陰道流出大量分泌物后將母兔撲殺,取子宮炎性分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),并觀察與先前接種的細(xì)菌是否一致。

1.5 血細(xì)胞成分分析 PE-6800Vet全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀,深圳市普康電子有限公司生產(chǎn)。血細(xì)胞分析儀應(yīng)用試劑PE-L01型溶血?jiǎng)?表面活性劑20 g/L、NaCl 6 g/L、緩沖劑4 g/L)、清洗液(濃縮)PE-CO2型(蛋白水解酶 250 mL/L、NaCl 7.5 g/L、食品著色劑 0.2 g/L、防腐劑2.5 g/L、緩沖劑4.0 g/L)、清洗液(強(qiáng)力)PE-CO3型(次氯酸鈉溶液120 mL/L、NaCl 8.6 g/L、表面活性劑2 g/L、防腐劑0.5 g/L、緩沖劑4.0 g/L)。對產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎患牛和正常奶牛白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中間細(xì)胞(MID)、粒細(xì)胞(GRAN)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度SD(RDW-SD)、紅細(xì)胞分布寬度 CV(RDW-CV)、血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板壓積(PCT)含量等進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定結(jié)果 通過染色觀察、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)等鑒別方法,從75份子宮分泌物樣中分離出葡萄球菌、鏈球菌和腸桿菌等189株,全部為混合感染。生化鑒定結(jié)果:共分離得到金黃色葡萄球菌56株(占29.62%),大腸埃希氏菌52株(占27.51%),銅綠假單胞菌 25株(占13.23%),蠟樣芽孢桿菌22株(占11.64%),無乳鏈球菌17株(占8.99%),停乳鏈球菌10株(占5.30%),沙門氏菌 3株(占1.59%),中間葡萄球菌2株(占1.06%),表皮葡萄球菌、普通變形桿菌各1株(各占0.53%),嚴(yán)格厭氧菌未分離到。詳見表1。

表1 各分離菌株的種類及部分特性

2.2 細(xì)菌致病性試驗(yàn)結(jié)果 母兔進(jìn)行子宮內(nèi)人工接種細(xì)菌后,除空白對照組外其余各組母兔接種第3天后即可看到少量膿性分泌物從母兔陰道流出且伴發(fā)陰道紅腫等癥狀,待母兔有大量炎性分泌物流出時(shí),將炎性分泌物涂片鏡檢,可見大量的膿球、白細(xì)胞和少量脫落的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞碎片;將子宮分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定均可見先前灌注的細(xì)菌。模型組1和對照組初期體溫略有升高,后基本恢復(fù)正常;模型組2和模型組3母兔均表現(xiàn)體溫升高。詳見圖1。

圖1 母兔攻菌期間的體溫變化

2.3 子宮內(nèi)膜炎患牛與健康奶牛血細(xì)胞成分比較子宮內(nèi)膜炎患牛與健康奶牛血細(xì)胞成分比較見表2。SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析表明,健康奶牛組和奶牛子宮內(nèi)膜炎組的LYM、GRAN、MCH、PDW、PCT差異極顯著(P＜0.01)。其余指標(biāo)差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論與小結(jié)

奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病原因比較復(fù)雜,產(chǎn)后4周子宮內(nèi)細(xì)菌感染是引發(fā)該病的主要原因[6-7]。據(jù)報(bào)道,引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌、克雷伯氏菌、棒狀桿菌和支原體等[8-11],本實(shí)驗(yàn)對新疆奶業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)6個(gè)規(guī)?；膛龅?5例子宮內(nèi)膜炎病進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定,共分離出葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鏈球菌等,基本與國內(nèi)外的報(bào)道一致。

表2 子宮內(nèi)膜炎患牛與健康奶牛血細(xì)胞成分比較

本次細(xì)菌致病性試驗(yàn)以母兔為實(shí)驗(yàn)對象,建立子宮內(nèi)膜炎模型,結(jié)果表明,正常母兔子宮內(nèi)人工接種細(xì)菌后初期母兔表現(xiàn)出體溫升高等,后期母兔的各項(xiàng)指標(biāo)均恢復(fù)正常,說明正常母兔的子宮自凈功能很強(qiáng),產(chǎn)后母兔組和產(chǎn)后并用韌物刺激產(chǎn)道的母兔組均表現(xiàn)出體溫升高并伴發(fā)有炎性分泌物從陰道流出,說明產(chǎn)后和產(chǎn)道損傷的母畜更易受到細(xì)菌的侵襲并引發(fā)子宮內(nèi)膜炎。這就要求在生產(chǎn)過程中要加強(qiáng)母畜的管理,產(chǎn)前要給予母畜一定的鍛煉,減少難產(chǎn)的發(fā)生,產(chǎn)后要及時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)以增強(qiáng)母畜的免疫力,并做好消毒工作,最大程度上減少子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病。

本次血細(xì)胞分析結(jié)果表明,子宮內(nèi)膜炎患牛血液中血紅蛋白及紅細(xì)胞的含量均普遍低于正常值,淋巴細(xì)胞比例下降,這與麻延峰[12]的報(bào)道結(jié)果一致。淋巴細(xì)胞是一種免疫活性細(xì)胞,不具有吞噬功能,主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。當(dāng)淋巴細(xì)胞比例下降,說明奶牛自身的免疫力低下,導(dǎo)致子宮內(nèi)一些新致病菌大量繁殖而引發(fā)子宮內(nèi)膜炎。粒細(xì)胞降低是由于試驗(yàn)選取化膿性子宮內(nèi)膜炎病例,由于患牛處于產(chǎn)后早期能量負(fù)平衡與免疫力低下狀態(tài),因此其吞噬能力大大降低,這提示我們應(yīng)該做好圍產(chǎn)后期飼養(yǎng)管理。由于新疆引進(jìn)了大量的澳洲荷斯坦牛,經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料,未發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)引進(jìn)奶牛血常規(guī)指標(biāo)的參考數(shù)據(jù),故本研究采用了新疆本地飼養(yǎng)條件下的奶牛的參考值。由于奶牛的飼養(yǎng)方式、地域環(huán)境、品種、氣候條件等因素的影響,新疆奶牛集中飼養(yǎng)地區(qū)尚需進(jìn)一步抽測不同發(fā)育階段、不同產(chǎn)后階段、不同年齡(胎次)、產(chǎn)奶水平、不同飼養(yǎng)方式下的奶牛的血常規(guī)指標(biāo),以便初步建立血細(xì)胞成分的參考標(biāo)準(zhǔn),對生產(chǎn)更具有實(shí)際意義。

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