毛楊毅,羅惠娣,郭慧慧,張喜中,王志武,李 俊,王棟才,張冠武,韓一超,田 輝

(山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,太原 030032)

山西省是我國養(yǎng)羊大省,具有豐富的山羊品種資源。黎城大青羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊[1-2]以及洪洞奶山羊都是山西著名的山羊業(yè)的主要生產(chǎn)資料,具有生產(chǎn)性能良好、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)良品質(zhì)。近年來,為適應(yīng)羊肉生產(chǎn)發(fā)展的需要,引入波爾山羊及南江黃羊等與本地品種進(jìn)行了試驗(yàn)性雜交,以期建立成熟的雜交繁育生產(chǎn)體系,為山西山羊羊肉生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。在山羊生產(chǎn)實(shí)踐中,雜種優(yōu)勢的預(yù)測及其利用日益重要,但傳統(tǒng)的雜種優(yōu)勢預(yù)測需要進(jìn)行雜交試驗(yàn)和配合力測定,既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記的產(chǎn)生為解決這些問題開創(chuàng)了新的途徑。

微衛(wèi)星是DNA序列中以2～6個(gè)短核苷酸為基本單位,重復(fù)10～20次,分布于生物整個(gè)基因組。因數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳以及檢測快速方便等優(yōu)點(diǎn)而倍受推崇,已被廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因定位、遺傳多樣性評(píng)估等方面。此外,微衛(wèi)星DNA多態(tài)性還被應(yīng)用于動(dòng)物雜交優(yōu)勢的預(yù)測。通過各品種在不同微衛(wèi)星座位的等位基因頻率計(jì)算出品種間的遺傳距離,了解其血緣關(guān)系的遠(yuǎn)近以預(yù)測雜種優(yōu)勢的大小。

在國內(nèi)其它省區(qū),瞿冬艷等[3]用微衛(wèi)星DNA對(duì)寧夏牧區(qū)主要綿羊群體的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析,并據(jù)此預(yù)測了雜種優(yōu)勢;張英杰等[4]則在利用微衛(wèi)星DNA分析3個(gè)山羊群體和部分綿羊品種遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ)上,對(duì)預(yù)測的雜種優(yōu)勢進(jìn)行了實(shí)際雜交驗(yàn)證。武艷平等[5]用微衛(wèi)星標(biāo)記研究我國部分山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)變異;李步高等[6]、常新建等[7]分別用RAPD技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記分析山西省部分山羊品種和外來部分山羊品種的遺傳親緣關(guān)系。但用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)山西省4個(gè)地方山羊品種及波爾山羊的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究未見報(bào)道。本研究利用微衛(wèi)星DNA從分子水平上分析5個(gè)山羊品種的遺傳多態(tài)性,計(jì)算了群體間的遺傳距離,據(jù)此對(duì)波爾山羊與4個(gè)地方品種間的雜種優(yōu)勢做了預(yù)測,旨在為山西省進(jìn)行山羊雜交改良、新品種培育等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品 2008年3—11月,在各品種內(nèi)采取特征明顯的40只羊的耳組織樣品,共采集樣品200份,放進(jìn)裝有70%～75%酒精的保溫壺中帶回實(shí)驗(yàn)室。其中黎城大青羊(LC)采自黎城縣種羊場,陽城白山羊(YC)采自陽城白山羊種羊場,呂梁黑山羊(LL)采自興縣高效生態(tài)養(yǎng)羊繁殖示范基地,洪洞奶山羊(HD)采自洪洞奶山羊育種場,波爾山羊(Boer)采自山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所種羊場。

1.1.2 微衛(wèi)星座位及引物序列 微衛(wèi)星座位、引物序列、染色體位置等相關(guān)信息均來自www.ncbi.nlm.nih.gov和www.marc.usda.gov兩個(gè)網(wǎng)站,見表1。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 5對(duì)微衛(wèi)星引物的信息

1.1.3 主要試劑 10×buffer、dNTP 、Mg2+、Taq酶、T ris平衡酚、丙烯酰胺等試劑均由太原市來寶生物工程有限公司提供;pBR322 DNA/Msp1由天根生化科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用酚-氯仿抽提法[8]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系10 μ L,其中各組分的終濃度或劑量分別為:1～2×buffer,dNTPs 100～400μ M,primer 1和primer 2各0.2～0.4 μ M,Mg2+1.5 ～ 2.0 mM,Taq 酶 0.5～ 1.0 u,基因組DNA 20～40 ng。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性 30 s,50～64℃退火 50 s,72℃延伸 1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃終末延伸5 min。

1.2.3 等位基因分離及大小計(jì)算 用8%～12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離微衛(wèi)星等位基因,經(jīng)硝酸銀染色后,用WD-9413A凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。再以pBR322 DNA/Msp1 Marker為標(biāo)準(zhǔn),利用ONE-Dscan軟件計(jì)算等位基因大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 參考引用相關(guān)文獻(xiàn)[9],對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用 Mstools、Fstat、Popgene、dispan 等軟件計(jì)算每個(gè)品種在各位點(diǎn)等位基因頻率(P)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、總?cè)后w遺傳分化系數(shù)(Gst)、品種間標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離 將5個(gè)山羊品種在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%～12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA片段,PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果參見圖1。從圖1可見,PCR產(chǎn)物擴(kuò)增以及基因分離效果良好。根據(jù)等位基因片段大小分別記錄為 a、b、c、d……等。

圖1 呂梁黑山羊(LL)BM6526位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 品種的遺傳多樣性 由表2可知,5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在5個(gè)山羊品種中共檢測到70.0個(gè)等位基因,各位點(diǎn)檢測到等位基因數(shù)9.0～21.0個(gè),平均14.0個(gè)。黎城大青羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊、洪洞奶山羊、波爾山羊在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)分別為:46.0、37.0、42.0、35.0、36.0個(gè)。依據(jù)等位基因組成,運(yùn)用Mstools軟件計(jì)算等位基因頻率。

表2 5個(gè)山羊品種各微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)

各品種在各位點(diǎn)觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)及平均 Ho、He、PIC、Ne等(表3)的計(jì)算,基于等位基因組成及頻率,運(yùn)用Mstools和popgene軟件。5個(gè)微衛(wèi)星座位的有效等位基因數(shù)3.33～15.46個(gè),平均7.99個(gè)。BM6526座位最多,MB056座位最少。5個(gè)山羊品種在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)平均有效等位基因數(shù)順序?yàn)?黎城大青羊＞呂梁黑山羊＞陽城白山羊＞波爾山羊＞洪洞奶山羊。

利用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在檢測5個(gè)山羊品種遺傳多態(tài)信息含量時(shí),除MB056位點(diǎn)在洪洞奶山羊多態(tài)信息含量0.444 6(0.25＜PIC＜0.5)為中度多態(tài)位點(diǎn)外,其它PIC＞0.5均為高度多態(tài)位點(diǎn)。5個(gè)山羊品種在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)平均遺傳多態(tài)信息含量以黎城大青羊最高,洪洞奶山羊最低。

各微衛(wèi)星位點(diǎn)基因雜合度在0.701 7～0.937 6之間,BM6526位點(diǎn)較大,MB056位點(diǎn)較小;5個(gè)山羊品種在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)平均基因雜合度順序?yàn)?黎城大青羊＞陽城白山羊＞呂梁黑山羊＞波爾山羊＞洪洞奶山羊。此結(jié)果與多態(tài)信息含量結(jié)果相一致。

表3 5個(gè)山羊品種在各微衛(wèi)星位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)、基因雜合度、多態(tài)信息含量

2.3 品種間遺傳分化 根據(jù)等位基因組成及頻率,使用popgene、dispan軟件,計(jì)算出在5個(gè)微衛(wèi)星點(diǎn)在各山羊品種間遺傳分化系數(shù)(表4)、標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(表5)。由表4可知,在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上,URB037位點(diǎn)遺傳分化系數(shù)最大(0.080 6),MB056位點(diǎn)最小(0.030 6),平均0.060 7。表明5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上各山羊品種間遺傳變異占總?cè)后w遺傳變異的6.07%,93.93%遺傳變異發(fā)生在品種內(nèi),可見品種間遺傳變異不大。

由表5可知,波爾山羊與呂梁黑山羊遺傳距離最大(0.508 3),與陽城白山羊(0.447 4)和洪洞奶山羊(0.433 2)次之,與黎城大青羊最小(0.330 1);黎城大青羊與陽城白山羊間遺傳距離最小(0.082 0),依次為黎城大青羊、陽城白山羊與呂梁黑山羊(0.107 0)、(0.153 0),呂梁黑山羊、陽城白山羊、黎城大青羊與洪洞奶山羊(0.304 2)、(0.337 4)、(0.353 5),波爾山羊與黎城大青羊、洪洞奶山羊、陽城白山羊、呂梁黑山羊間為最大。

表4 5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的總?cè)后w基因多樣度(Ht)、群體內(nèi)基因多樣度(Hs)及基因分化系數(shù)(Gst)

表5 5個(gè)山羊品種間遺傳距離

3 討論

3.1 品種遺傳變異分析 等位基因是衡量微衛(wèi)星座位多態(tài)性的一個(gè)重要參數(shù)。根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記選擇標(biāo)準(zhǔn),每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)至少應(yīng)有4個(gè)等位基因方能較好地用于遺傳多樣性的評(píng)估[10]。本研究結(jié)果為:5個(gè)山羊品種在各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)都在4.0個(gè)以上,各位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)為9.0～21.0個(gè),均比報(bào)道的多,說明選擇的5個(gè)微衛(wèi)星座位多態(tài)性豐富,可用于5個(gè)山羊品種遺傳多樣性的評(píng)估。

有效等位基因數(shù)(Ne)、基因雜合度(H)、遺傳多態(tài)信息含量(PIC)都是衡量品種內(nèi)遺傳變異程度及座位多態(tài)信息量的指標(biāo)[11]。趙艷紅等[12]、武艷平等[5]、常新建等[7]、王杰等[13]、潘建文等[14]用微衛(wèi)星標(biāo)記分別分析了中國部分山羊群體及山西、四川、福建省部分地方山羊品種的遺傳多樣性,結(jié)果為:中國6個(gè)山羊群體平均有效等位基因數(shù)為2.571～4.915個(gè),平均多態(tài)信息含量在0.533 0～0.639 0之間,平均遺傳雜合度在0.367 0～0.467 0之間;我國5個(gè)山羊品種平均有效等位基因數(shù)為4.66～6.05個(gè),平均多態(tài)信息含量在0.724 0～0.784 0之間,平均遺傳雜合度在0.768 0～0.820 0之間;5個(gè)山羊群體平均有效等位基因數(shù)為7.776 5～11.506 0個(gè),平均多態(tài)信息含量在0.834 1～0.902 6之間,平均遺傳雜合度在0.859 4～0.911 5之間;四川9個(gè)黑山羊品種平均有效等位基因數(shù)4.273～5.281個(gè),平均多態(tài)信息含量在0.697 0～0.770 0之間,平均遺傳雜合度在0.742 0～0.801 0之間;福建地方山羊品種平均有效等位基因數(shù)4.46～5.60個(gè),平均多態(tài)信息含量在0.729 4～0.780 8之間,平均遺傳雜合度在0.767 2～0.807 9之間。本研究的結(jié)果為:5個(gè)山羊品種平均有效等位基因數(shù)為4.94～6.05個(gè),平均遺傳多態(tài)信息含量在0.705 3～0.798 2之間,平均基因雜合度在0.759 2～0.831 6之間?？梢姳狙芯拷Y(jié)果與武艷平等[5]、王杰等[13]、潘建文等[14]的結(jié)果相似,略高于趙艷紅等的結(jié)果[12],略低于常新建等的結(jié)果[7]。結(jié)果表明,5個(gè)山羊品種遺傳變異程度高、多態(tài)性豐富及選擇潛力大;5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)位點(diǎn)、多態(tài)信息量大,能夠從分子水平上反映5個(gè)山羊品種內(nèi)遺傳變異及品種間遺傳關(guān)系,可作為有效遺傳標(biāo)記用于山羊品種的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建分析。

另外,在5個(gè)山羊品種中,黎城大青羊的平均有效等位基因數(shù)、基因雜合度、多態(tài)信息含量3項(xiàng)指標(biāo)最大,而洪洞奶山羊最小,表明黎城大青羊的遺傳變異程度較其它4個(gè)山羊品種大,而洪洞奶山羊則小。這可能是洪洞奶山羊目前數(shù)量較少、遺傳資源不廣泛造成的原因。

3.2 品種間親緣關(guān)系分析 遺傳距離是度量品種間、物種間遺傳變異及基因差異程度的某種數(shù)值。李步高等[6]、常新建等[7]分別用RAPD技術(shù)、微衛(wèi)星標(biāo)記研究波爾山羊與山西部分地方山羊品種間遺傳距離,結(jié)果均為波爾山羊與呂梁黑山羊間遺傳距離大于與黎城大青羊間遺傳距離。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果:波爾山羊與山西4個(gè)地方山羊品種間標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS)順序?yàn)?波爾山羊與呂梁黑山羊＞波爾山羊與陽城白山羊＞波爾山羊與洪洞奶山羊＞波爾山羊與黎城大青羊。此結(jié)果與李步高等[6]、常新建等[7]研究結(jié)果基本一致。

3.3 雜種優(yōu)勢推測 雜種優(yōu)勢理論認(rèn)為[15],雜種優(yōu)勢的大小在一定程度上取決于親本間的遺傳差異大小,即親本間遺傳距離。遺傳距離越大,遺傳分化越大,雜交優(yōu)勢越大,雜交效果越好。瞿冬艷等[3]用微衛(wèi)星標(biāo)記分析寧夏牧區(qū)主要綿羊群體間遺傳距離,并預(yù)測雜種優(yōu)勢;張英杰等[4]在用微衛(wèi)星DNA分別進(jìn)行3個(gè)山羊群體間、5個(gè)綿羊品種間遺傳距離分析的基礎(chǔ)上,對(duì)預(yù)測的雜種優(yōu)勢做了實(shí)際雜交驗(yàn)證。李步高等[6]用RAPD技術(shù)對(duì)波爾山羊與山西部分地方山羊品種間遺傳距離進(jìn)行研究,得出波爾山羊與呂梁黑山羊的雜種優(yōu)勢較與其它幾個(gè)品種大。據(jù)本研究結(jié)果,波爾山羊與呂梁黑山羊雜交,可望獲得較大的雜種優(yōu)勢,與陽城白山羊和洪洞奶山羊的雜種優(yōu)勢次之,與黎城大青羊的雜種優(yōu)勢較小。此結(jié)果與李步高等[6]研究結(jié)果基本一致。

致謝:黎城縣種羊場、陽城白山羊種羊場、興縣高效生態(tài)養(yǎng)羊繁殖示范基地、洪洞奶山羊育種場的同仁們對(duì)本文采集樣品的支持。

[1]趙有璋.現(xiàn)代中國養(yǎng)羊[M].北京:金盾出版社,2005:177-213.

[2]呂效吾,王業(yè)福,馬任騮,等.山西家畜家禽品種志[M].上海:華東師范大學(xué)出版社,1983:95-109.

[3]瞿冬艷,陳仁金,毛永紅,等.寧夏牧區(qū)主要綿羊品種遺傳多樣性分析及群體間雜種優(yōu)勢預(yù)測[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(1):1-6.

[4]張英杰,趙有璋,劉月琴,等.3個(gè)山羊群體中4個(gè)微衛(wèi)星DNA多態(tài)性及其與雜種優(yōu)勢關(guān)系[J].遺傳,2004,26(5):631-636.

[5]武艷平,馬月輝,韓俊文,等.5個(gè)山羊品種的遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(6):709-714.

[6]李步高,杜美紅,郭曉紅,等.Boer山羊與山西地方山羊品種聚類分析[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,25(3):243-244.

[7]常新建,任有蛇,岳文斌,等.5個(gè)山羊群體微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J].草食家畜,2009(1):22-27.

[8]羅惠娣,毛楊毅,張麗,等.山西省六個(gè)地方羊品種微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2010,31(1):17-24.

[9]郭小雅,楊章平,常洪,等.我國6個(gè)綿(山)羊群體遺傳分化的微衛(wèi)星分析[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39(5):16-20.

[10]苑存忠,王建民,馬月輝,等.山東地方綿羊品種微衛(wèi)星遺傳多態(tài)性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2006,17(8):1459-1464.

[11]王吉振,儲(chǔ)明星,王愛國,等.用4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析7個(gè)綿羊群體之間的遺傳關(guān)系[J].遺傳,2004,26(5):637-643.

[12]趙艷紅,何曉紅,關(guān)偉軍,等.中國6個(gè)山羊群體微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,38(1):20-24.

[13]王杰,陳明華,華太才讓,等.四川9個(gè)黑山羊品種(群體)微衛(wèi)星DNA多態(tài)性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(11),1124-1129.

[14]潘建文,梁學(xué)斌,劉慶華,等.用微衛(wèi)星標(biāo)記分析福建地方羊品種及波爾山羊的遺傳多樣性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào),2009,38(2):144-149.

[15]王淑新,連林生.畜禽雜種優(yōu)勢預(yù)測方法的研究進(jìn)展[J].當(dāng)代畜牧,2008(1):39-42.