張靜思,孫長(zhǎng)凱,樸 花

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 七年制臨床醫(yī)學(xué)系2005級(jí)，遼寧 大連116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室和腦疾病研究所，遼寧 大連 116044)

在熒光顯微鏡領(lǐng)域中，雙光子顯微鏡(two-photon laser scanning microscopy,TPLSM)在過(guò)去20年里是一種不可或缺的工具，TPLSM的優(yōu)勢(shì)在神經(jīng)科學(xué)的離體和活體組織研究中發(fā)揮著重要的作用。

TPLSM圖像具有鮮明的高對(duì)比度，結(jié)合其內(nèi)在三維分辨率及對(duì)生物組織的優(yōu)越穿透深度，使該技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛[1]。腦結(jié)構(gòu)成像是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域重要的研究方法之一，它為腦組織的形態(tài)及功能研究提供重要依據(jù)。但腦組織的密度、復(fù)雜性及其對(duì)光線(xiàn)的散射作用，給高分辨率的光學(xué)成像和生物活性化合物(籠狀化合物)的活化過(guò)程造成了障礙，而雙光子顯微鏡的應(yīng)用可有效減少這些障礙[2,3]。1990年，Denk等[4]最先使用飛秒脈沖激光對(duì)TPLSM的作用進(jìn)行了測(cè)試和應(yīng)用：兩個(gè)光子的同時(shí)吸收使TPLSM具有內(nèi)在的三維成像功能，熒光激發(fā)及光漂白的發(fā)生均被限制在聚焦平面處。此外，TPLSM在光化學(xué)尤其是光解釋放籠狀分子方面的優(yōu)勢(shì)更為突出。TPLSM的上述優(yōu)勢(shì)使其在對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)成像的過(guò)程中較單光子顯微鏡有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。

1 雙光子顯微鏡的一般概況

Ania Majewska等研究并介紹了他們將共聚焦系統(tǒng)改造為雙光子顯微鏡的過(guò)程，這一系統(tǒng)包括激光器、光學(xué)平臺(tái)和顯微鏡。改裝過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，可在短時(shí)間內(nèi)完成。改裝所得的激光掃描顯微鏡很靈活，較商業(yè)雙光子裝置花費(fèi)少。雙光子顯微鏡能將熒光基團(tuán)的激發(fā)局限于一很小的聚焦平面內(nèi)，該特性使雙光子顯微鏡較單光子共聚焦顯微鏡具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)增加了激發(fā)光線(xiàn)的穿透深度。TPLSM聯(lián)合熒光鈣指示劑，使對(duì)活體大鼠的體內(nèi)研究深度達(dá)到了500 μm處的錐體神經(jīng)元；(2)因?yàn)榫劢蛊矫嫱獠粫?huì)產(chǎn)生熒光，觀察過(guò)程中顯微鏡不需要針孔，所以熒光收集的效率得以提高；(3)雙光子激發(fā)顯著降低總體光漂白和光損傷效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間的成像。Squirrell 等人使用TPLSM研究倉(cāng)鼠胚胎內(nèi)的線(xiàn)粒體動(dòng)態(tài)分布，頻繁成像時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)24 h，而單光子共聚焦成像8 h即會(huì)造成明顯的組織損傷；(4)局限化的激發(fā)可用來(lái)光解籠狀化合物。如可用來(lái)研究Ca2+相關(guān)的亞微米級(jí)研究領(lǐng)域?qū)a2+的釋放作用，包括一些離子門(mén)控通道，Ca2+敏感的酶類(lèi)及Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞生理過(guò)程等；(5)通過(guò)對(duì)熒光光致漂白恢復(fù)過(guò)程的觀察，可對(duì)具有熒光基團(tuán)的物質(zhì)進(jìn)行研究，如觀察大鼠海馬切片中樹(shù)突棘和樹(shù)突干之間的物質(zhì)交換及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的彌散率[5]。共聚焦顯微鏡和TPLSM的比較性研究顯示，目前一些共聚焦顯微鏡因其光線(xiàn)不夠充分，從而不能使后焦平面得到有效均勻的照明，這是影響共聚焦顯微鏡最終分辨率的一個(gè)限制因素。并且，擴(kuò)大共聚焦顯微鏡的針孔不但不會(huì)帶來(lái)寬視野分辨率，反而會(huì)使分辨率較寬視野顯微鏡更低。相反的，在雙光子和二次諧波顯微鏡的實(shí)際應(yīng)用中沒(méi)有針孔和理論上的限制因素的存在。對(duì)于TPLSM，照射后焦平面的光線(xiàn)是十分充足的，因而完全解決了上述影響最終分辨率的限制因素，在TPLSM的實(shí)際應(yīng)用中將不會(huì)造成任何障礙?？傊?，“共聚焦”這一技術(shù)上提高的全部?jī)?yōu)點(diǎn)均能在非線(xiàn)性(雙光子和二次諧波)顯微鏡得到充分的體現(xiàn)[6]。

2 雙光子顯微鏡在神經(jīng)組織切片和整體分離樣品中的應(yīng)用

神經(jīng)組織的切片研究盡管有其局限性，但目前仍在神經(jīng)科學(xué)研究中占有重要的地位。在大鼠海馬結(jié)構(gòu)急性切片研究中，TPLSM和全細(xì)胞膜片鉗的聯(lián)合應(yīng)用證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在棘突增大和突觸強(qiáng)化過(guò)程中起必不可少的作用。實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合雙光子長(zhǎng)時(shí)間成像和全細(xì)胞膜片鉗記錄可同時(shí)監(jiān)測(cè)CA1神經(jīng)元的棘突大小及突觸反應(yīng)(興奮性突觸后電位)。在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的過(guò)程中，MMP-9的作用是一種局部的、指導(dǎo)性的細(xì)胞外信號(hào)，此信號(hào)可以協(xié)調(diào)地鞏固突觸結(jié)構(gòu)和功能性的修飾，確保這些對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶有重要意義的修飾的持續(xù)性。這里描述的嗅球細(xì)胞可塑性機(jī)制有可能是MMP-9參與認(rèn)知功能的有力的論證[7]。

應(yīng)用雙光子激發(fā)顯微鏡對(duì)活體急性切片中的呼吸性神經(jīng)元進(jìn)行鈣成像。樣品中包含前包欽格復(fù)合體，前包欽格復(fù)合體中含有對(duì)呼吸節(jié)律的產(chǎn)生有重要意義的神經(jīng)元。傳統(tǒng)熒光成像的時(shí)間分辨率是充分的，可達(dá)10 Hz，甚至更好，但因聚焦點(diǎn)外熒光的影響，傳統(tǒng)熒光顯微鏡的z軸分辨率受到了限制。雙光子激發(fā)顯微鏡可有效解決這一問(wèn)題，因?yàn)樗募ぐl(fā)過(guò)程局限在圍繞聚焦平面的很小的范圍內(nèi)(盡管z軸的分辨率依舊低于x或y軸)。但是，針孔濾過(guò)技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)就是時(shí)間分辨率較低。此實(shí)驗(yàn)結(jié)合細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的活體急性切片樣品、雙光子激發(fā)顯微鏡及鈣指示劑染料，證實(shí)甘氨酸的抑制作用在功能上與前包欽格復(fù)合體驅(qū)動(dòng)的網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)是一體性的，因而，局部甘氨酸抑制環(huán)路對(duì)于呼吸節(jié)律的產(chǎn)生和維持具有重要意義[8]。

在有關(guān)錐體細(xì)胞水通道的實(shí)驗(yàn)中，有研究者應(yīng)用TPLSM對(duì)錐體細(xì)胞的胞體、樹(shù)突及棘突進(jìn)行了觀察，且對(duì)切片內(nèi)深達(dá)60～150 μm的苔狀纖維進(jìn)行了20 min的成像過(guò)程。該實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)元缺少功能性的水通道蛋白，從而使其在滲透壓急劇變化時(shí)仍能保持一定的體積。然而，在這一應(yīng)用過(guò)程中，TPLSM表現(xiàn)出一些不足，如切片體積的變化會(huì)使聚焦平面上的神經(jīng)結(jié)構(gòu)移位(盡管這種移位本身也是膠質(zhì)細(xì)胞體積變化的一種指示)。另外，缺氧缺糖情況下經(jīng)常能觀測(cè)到熒光物質(zhì)的褪色，這也會(huì)給成像造成一定的困難[9]。

人們推測(cè)嗅球的中間神經(jīng)元可調(diào)節(jié)它的輸入和輸出，但尚不清楚中間神經(jīng)元對(duì)嗅球功能所起的具體作用，且人們對(duì)新生中間神經(jīng)元的功能了解得更少。有研究者在此展示了一種新方法，這種方法可用來(lái)研究小鼠嗅球內(nèi)大量新生顆粒細(xì)胞的空間分布模式。應(yīng)用雙光子顯微鏡在單細(xì)胞的分辨率水平上對(duì)嗅球冠狀切片(250 μm)進(jìn)行半自動(dòng)成像是該方法的基礎(chǔ)。這一方法可辨別出嗅球內(nèi)數(shù)千個(gè)標(biāo)記神經(jīng)元的確切位置，因此可降低抽樣誤差。為了驗(yàn)證概念，研究者對(duì)兩個(gè)嗅球中的新生顆粒細(xì)胞進(jìn)行了成像和分析。結(jié)果證明這種大規(guī)模的三維分析可以揭示較薄組織切片不能提供的信息。在研究過(guò)程中，盡管雙光子成像經(jīng)證實(shí)可以穿透厚組織深達(dá)500 μm以上，但對(duì)深部組織的成像，其質(zhì)量也有一定的下降，尤其在嗅球中。當(dāng)對(duì)嗅球切片175～200 μm以上深度進(jìn)行成像時(shí)，圖像顯示的熒光較弱且綠色熒光標(biāo)記蛋白較少。檢測(cè)到的細(xì)胞密度降低是由于釋放的光學(xué)信號(hào)減弱所造成的，只有最亮的細(xì)胞才可被檢測(cè)到。這一問(wèn)題在不同的組織中是不同的，所以在不同的樣品中應(yīng)進(jìn)行不同的評(píng)估[10]。

盡管器官切片和培養(yǎng)等方法在神經(jīng)科學(xué)研究中十分重要，但它們固有的一些不足也是不容忽視的。在器官切片培養(yǎng)的條件下，神經(jīng)元及其網(wǎng)絡(luò)的很多特性都不能正常發(fā)育，如星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟過(guò)程。另外，神經(jīng)元形態(tài)的發(fā)生有賴(lài)于多種因素，而這些因素是很難在體外模擬的，諸如神經(jīng)元的活動(dòng)模式、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的存在。因此，對(duì)完整腦結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究對(duì)神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展具有重要意義[11]，故目前在整體情況下進(jìn)行的研究日益增多。將鼠斷頭取腦后，將腦置于用含氧和蔗糖的冷人工腦脊液浸泡過(guò)的濾紙上。然后將其置入盛有人工腦脊液的培養(yǎng)皿中，沿中線(xiàn)切開(kāi)。將海馬和覆于其上的新皮層從腦干上分離。再用解剖刀將海馬及新皮層從剩余腦組織上分離下來(lái)。將一尼龍刷放進(jìn)側(cè)腦室將海馬結(jié)構(gòu)從覆蓋著的新皮質(zhì)中卷出來(lái)然后在下托部位切斷。制備新皮質(zhì)和海馬的整體結(jié)構(gòu)樣品的目的在于創(chuàng)建一種既有腦片優(yōu)點(diǎn)(如保持了神經(jīng)元固有的特性)，又可避免心臟和呼吸運(yùn)動(dòng)影響的標(biāo)本。另外，這些標(biāo)本還有一些重要的新品質(zhì)，如保存了局部所有的輸入和輸出途徑、避免了切片和三維組織結(jié)構(gòu)保存時(shí)所造成的表面損傷。此外，也證實(shí)了這些整體樣品的長(zhǎng)期(hours)活力。TPLSM成像技術(shù)可對(duì)整體樣品從表面至400 μm的深度進(jìn)行觀察，見(jiàn)圖1[12]。這些樣品和雙光子顯微鏡技術(shù)的結(jié)合無(wú)疑會(huì)為神經(jīng)科學(xué)的整體研究工作帶來(lái)新希望。

3 雙光子顯微鏡在活體動(dòng)物的完整腦結(jié)構(gòu)中的

應(yīng)用

如今，雙光子顯微鏡已更多的用于觀測(cè)活體動(dòng)物的完整腦結(jié)構(gòu)，從而為研究提供進(jìn)一步的便利。以膠質(zhì)細(xì)胞的研究為例，為明確星形膠質(zhì)細(xì)胞在信息處理中的作用，研究者面臨的主要挑戰(zhàn)正是從半完好的樣品研究轉(zhuǎn)向活的、整體動(dòng)物，以使星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)處于與皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)直接相連的條件下。因?yàn)樾切文z質(zhì)細(xì)胞不能像神經(jīng)元一樣通過(guò)電生理學(xué)方法來(lái)研究，TPLSM成像技術(shù)成為一種重要的替代方法，它的激發(fā)光線(xiàn)可以輕易的透過(guò)皮層組織，深達(dá)約150 μm，且不會(huì)造成明顯的組織損傷[3]。又如，在小鼠局灶性缺血模型的相關(guān)研究中，TPLSM也起到了非常重要的作用。此模型的制備提供了TPLSM對(duì)體內(nèi)腦組織進(jìn)行成像的一種方法：將小鼠顱骨厚度減小至≈20 μm。此削薄技術(shù)不會(huì)造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)TPLSM的成像深度自軟腦膜表面可深達(dá)約100～200 μm，最后，獲得的圖像可進(jìn)行選擇性三維重建。該模型使研究者能同時(shí)監(jiān)測(cè)栓塞物的發(fā)展和活體小鼠中樹(shù)突結(jié)構(gòu)對(duì)缺血發(fā)生的反應(yīng)及變化[13]。最近，對(duì)小鼠新皮質(zhì)體驗(yàn)-依賴(lài)性結(jié)構(gòu)可塑性的研究中，研究者也利用了活鼠體內(nèi)TPLSM成像技術(shù)[14]，以脊柱受損小鼠為模型，定量研究其血管和軸突網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化。研究者發(fā)明了一種專(zhuān)門(mén)的非侵入性體內(nèi)成像流程，它可檢測(cè)脊柱內(nèi)受損軸突的變性和再生的動(dòng)態(tài)過(guò)程，同時(shí)它也可對(duì)同一動(dòng)物血管網(wǎng)的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。以往研究中常難以區(qū)分存活軸突和新生軸突，重復(fù)成像過(guò)程提供了區(qū)分存活的軸突和新生軸突的一種獨(dú)特方式。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，再生的軸突在生長(zhǎng)過(guò)程中傾向于與血管緊密接觸，因?yàn)檠茉跔I(yíng)養(yǎng)方面為軸突提供了獲得適宜環(huán)境的快速通道。這種親和性持續(xù)的時(shí)間超過(guò)了血管生成反應(yīng)的高峰期，同時(shí)也涉及到非新生血管，如足背靜脈。這種神經(jīng)血管間的相互作用增加了軸突萌芽的動(dòng)力，也使軸突延長(zhǎng)的速度達(dá)到了驚人的程度(高達(dá)80 μm/h)。這種體內(nèi)延時(shí)實(shí)驗(yàn)鮮明的突出了這一現(xiàn)象。而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于組織光學(xué)特性的限制，穿透深度僅達(dá)脊柱背索表面的200 μm，這些部位的血管形成在控制條件下是比較適宜的[15]。

圖1 雙光子顯微鏡對(duì)小鼠整個(gè)海馬結(jié)構(gòu)中齒狀回的成像(A)完整海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞層和分子層。顆粒細(xì)胞的樹(shù)突從胞體發(fā)出直達(dá)分子層并向外朝著表面。箭頭示從顆粒細(xì)胞胞體延伸出的軸突遠(yuǎn)離表面；(B)齒狀回顆粒細(xì)胞在較高放大倍數(shù)時(shí)的成像。箭頭示離開(kāi)胞體的軸突。樹(shù)突延伸自胞體的其它面并朝著海馬結(jié)構(gòu)的表面行進(jìn)Fig 1 Dentate gyrus of the mouse whole hippocampal formation (HF) imaged with 2PLSM(A) Granule cell layer and molecular layer of the dentate gyrus in the intact hippocampus.The dendrites of the granule cells extend from the cell body through the molecular layer and out towards the surface.The arrow indicates an axon extending from a granule cell body away from the surface；(B) A higher magnification image of granule cells in the dentate gyrus.The arrow indicates the axon exiting the cell body.The dendrites extend from the other side of the soma and travel toward the surface of the hippocampal formation

用雙光子激光切斷脊柱中綠色熒光蛋白標(biāo)記的單根感覺(jué)神經(jīng)元軸突，可造成較小的損傷，且周?chē)窠?jīng)組織中形成的瘢痕也較小。在研究感覺(jué)神經(jīng)元再生能力時(shí)，利用了雙光子損傷模型。研究表明，周?chē)鷵p傷將導(dǎo)致中央損傷的感覺(jué)神經(jīng)元中再生相關(guān)性基因上調(diào)。經(jīng)外周軸突損傷處理過(guò)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，在中央損傷之前已表達(dá)了軸突生長(zhǎng)所必須的分子。應(yīng)用體內(nèi)成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)條件處理(外周軸突損傷)的軸突迅速開(kāi)始生長(zhǎng)，并在48 h內(nèi)，組織瘢痕尚不明顯的情況下穿越損傷部位。研究數(shù)據(jù)證明，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的慢性損傷可引發(fā)強(qiáng)大的再生潛力。然而，生長(zhǎng)能力的實(shí)現(xiàn)會(huì)因損傷部位的創(chuàng)傷性改變而受阻。結(jié)果提示，誘導(dǎo)的條件效應(yīng)，結(jié)合一定的干預(yù)來(lái)減少瘢痕抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)的本性，這將為慢性脊柱損傷提供極具前景的治療方法[16]。

盡管人們已確信，神經(jīng)元活動(dòng)是動(dòng)物行為最為主要的一個(gè)決定性因素，但星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活與動(dòng)物行為間的關(guān)系仍不明了。小腦伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞是放射狀星形細(xì)胞，它們參與運(yùn)動(dòng)行為，且有鈣離子激發(fā)活性。然而，以往少有人探討動(dòng)物行為中這些細(xì)胞中的鈣離子激發(fā)。通過(guò)雙光子顯微鏡，研究者發(fā)現(xiàn)在清醒活動(dòng)中的小鼠，伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出三種形式的鈣離子激發(fā)，其中兩種發(fā)生在小腦蚓部。當(dāng)小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)時(shí)，至少有上百個(gè)伯格曼膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)了協(xié)調(diào)性的鈣激發(fā)，這些細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的范圍可達(dá)幾百微米甚至更多。麻醉、阻斷神經(jīng)活動(dòng)或谷氨酸傳輸均可破壞鈣離子的協(xié)調(diào)性激發(fā)。由此可得出，伯格曼細(xì)胞的大網(wǎng)絡(luò)可被特定的動(dòng)物活動(dòng)所激活，并有可能通過(guò)足量振幅的激活來(lái)啟動(dòng)腦組織動(dòng)力學(xué)或血流的宏觀變化。研究者發(fā)明了一種雙光子成像方法，對(duì)清醒狀態(tài)下、頭部固定的小鼠小腦進(jìn)行成像。在此過(guò)程中，小鼠可在健身球上移動(dòng)，研究者就可以探討覺(jué)醒狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)行為是如何影響正常情況下伯格曼膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中鈣離子的激發(fā),見(jiàn)圖2[17]。

圖2 對(duì)行為小鼠小腦皮質(zhì)的雙光子顯微鏡檢查

用雙光子顯微鏡檢查覺(jué)醒著的頭部受限且使用健身球的小鼠。小鼠的運(yùn)動(dòng)通過(guò)光編碼器示蹤，此編碼器對(duì)運(yùn)動(dòng)的開(kāi)始/偏移、速度及方向提供敏感、定量、可重復(fù)的示值讀數(shù)。此外，通過(guò)錄像記錄小鼠的行為
Fig 2 Two-Photon Microscopy in Cerebellar Cortex of Behaving Mice

Two-photon microscopy in awake,head-restrained mouse using an exercise ball.Mouse locomotion is tracked by an optical encoder on the ball,which provides a sensitive,quantitative,and repeatable readout of running onset/offset,speed,and direction.In addition,mouse behavior is recorded by a video camera

在一定范圍內(nèi)，正常組織生成局部信號(hào)的方式之一是多個(gè)伯格曼神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的突起部位同時(shí)產(chǎn)生自發(fā)性鈣波。利用TPLSM技術(shù)，研究者首次展示了在活體完整的腦組織內(nèi)，嘌呤型機(jī)制可以激發(fā)細(xì)胞間的鈣波傳遞[18]。

4 雙光子顯微鏡技術(shù)的局限性和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

盡管雙光子顯微鏡被廣泛應(yīng)用于不同的研究體系中，但它仍受限于一個(gè)相當(dāng)小的光譜窗口。目前，雙光子顯微鏡的光源依舊是Ti：Sa飛秒激光提供的大約在700～1000 nm之間的輸出。因此，雙光子的有效激發(fā)波長(zhǎng)局限于350～500 nm之間。S.Quentmeier提出克服這些局限的方法之一就是將雙光子激發(fā)擴(kuò)展為雙色雙光子激發(fā)。雙色雙光子激光掃描顯微鏡(two-color two-photon laser scanning microscopy,2c2pLSM)的試驗(yàn)裝置中，使用的是Ti：

Sa 800 nm的基本輸出和400 nm的二次諧波。這些光柱在時(shí)間和空間上的重疊可以達(dá)到雙色雙光子的吸收和266 nm的有效激發(fā)波長(zhǎng)。因此，使用2c2pLSM的顯微鏡其激發(fā)范圍可以達(dá)到紫外光，如230～330 nm。因?yàn)榇朔秶鷦偤眠m合于色氨酸的吸收光譜(色氨酸是一種與大多數(shù)固有的蛋白熒光相關(guān)的氨基酸，色氨酸相當(dāng)于一種自然的內(nèi)置監(jiān)測(cè)器)。因此，2c2pLSM顯微鏡不僅可以檢測(cè)非標(biāo)記的蛋白質(zhì)，而且可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的反應(yīng)及構(gòu)象變化。

使用280 nm光線(xiàn)單光子激發(fā)色氨酸是最顯著的方法，但在共聚焦或?qū)捯曇盁晒怙@微鏡中使用這一波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)會(huì)引起很多問(wèn)題，包括紫外線(xiàn)的光毒性、短波長(zhǎng)光線(xiàn)的散射問(wèn)題，以及所需的特殊光纖、具有理想孔徑的物鏡的限制。相比之下，2c2pLSM較小的激發(fā)面積和較長(zhǎng)的波長(zhǎng)可以解決這些問(wèn)題。研究者展示了MIN 6(Pancreatic β cell line,MIN6)細(xì)胞的第一張2c2pLSM熒光圖像，從而證實(shí)了該方法在活細(xì)胞內(nèi)紫外熒光基團(tuán)成像過(guò)程中的實(shí)用性。另外，有研究者使用時(shí)間門(mén)控相機(jī)結(jié)合檢流計(jì)-光學(xué)光束掃描(galvo-optic beam scanning)證實(shí)了2c2pLSM可監(jiān)測(cè)生物素與親和素的結(jié)合過(guò)程[1]。

相信在未來(lái)的發(fā)展過(guò)程中，雙光子顯微鏡在神經(jīng)科學(xué)及諸多其他科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將會(huì)更加寬廣。

[1] Quentmeier S,Denicke S,Gericke KH.Two-Color Two-Photon Fluorescence Laser Scanning Microscopy[J].J Fluoresc,2009,19(6):1037-1043.

[2] Denk W,Delaney KR,Gelperin A,et al.Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy[J].J Neurosci Methods,1994,54(2):151-162.

[3] Tian GF,Takano T,Lin JH,et al.Imaging of cortical astrocytes using 2-photon laser scanning microscopy in the intact mouse brain[J].Adv Drug Deliv Rev,2006,58(7):773-787.

[4] Denk W,Strickler JH,Webb WW.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J].Science,1990,248(4951):73-76.

[5] Rubart M.Two-photon microscopy of cells and tissue[J].Circ Res,2004,95(12):1154-1166.

[6] Cox G,Sheppard CJ.Practical limits of resolution in confocal and non-linear microscopy[J].Microsc Res Tech,2004,63(1):18-22.

[7] Wang XB,Bozdagi O,Nikitczuk JS,et al.Extracellular proteolysis by matrix metalloproteinase-9 drives dendritic spine enlargement and long-term potentiation coordinately[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(49):19520-19525.

[8] Winter SM,Fresemann J,Schnell C,et al.Glycinergic interneurons are functionally integrated into the inspiratory network of mouse medullary slices[J].Pflugers Arch,2009,458(3):459-469.

[9] Andrew RD,Labron MW,Boehnke SE,et al.Physiological evidence that pyramidal neurons lack functional water channels[J].Cereb Cortex,2007,17(4):787-802.

[10] Kopel H,Meshulam M,Mizrahi A.Three-dimensional distribution patterns of newborn neurons in the adult olfactory bulb[J].J Neurosci Methods,2009,182(2):189-194.

[11] Chen BE,Lendvai B,Nimchinsky EA,et al.Imaging high-resolution structure of GFP-expressing neurons in neocortex in vivo[J].Learn Mem,2000,7(6):433-441.

[12] Davies ML,Kirov SA,Andrew RD.Whole isolated neocortical and hippocampal preparations and their use in imaging studies[J].J Neurosci Methods,2007,166(2):203-216.

[13] Zhang ZG,Zhang L,Ding G,et al.A model of mini-embolic stroke offers measurements of the neurovascular unit response in the living mouse[J].Stroke,2005,36(12):2701-2704.

[14] Holtmaat A,De Paola V,Wilbrecht L,et al.Imaging of experience-dependent structural plasticity in the mouse neocortex in vivo[J].Behav Brain Res,2008,192(1):20-25.

[15] Dray C,Rougon G,Debarbieux F.Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(23):9459-9464.

[16] Ylera B,Ert rk A,Hellal F,et al.Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon[J].Curr Biol,2009,19(11):930-936.

[17] Nimmerjahn A,Mukamel EA,Schnitzer MJ.Motor behavior activates Bergmann glial networks[J].Neuron,2009,62(3):400-412.

[18] Hoogland TM,Kuhn B,G bel W,et al.Radially expanding transglial calcium waves in the intact cerebellum[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(9):3496-3501.