馮 悅,張忠華,龔福明,柳陳堅

鸚鵡熱嗜性衣原體特異性TaqMan-M GB探針熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用＊

馮 悅,張忠華,龔福明,柳陳堅

目的 建立一種特異、靈敏、重復(fù)性好的鸚鵡熱嗜性衣原體的 TaqMan-M GB熒光定量PCR檢測方法。方法利用鸚鵡熱嗜性衣原體MOM P基因的特異保守序列設(shè)計引物和M GB探針,通過優(yōu)化,獲得最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件,同時進(jìn)行特異性、重復(fù)性、靈敏性評價與Spike-test實驗進(jìn)行臨床應(yīng)用性評價,利用該檢測方法對禽鳥類糞便樣品進(jìn)行檢測,并與常規(guī)PCR檢測方法進(jìn)行比較。結(jié)果該方法在0.01pg～100pg范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.999,擴(kuò)增效率為97.7%;對鸚鵡熱嗜性衣原體菌株檢測結(jié)果均呈現(xiàn)陽性,而非鸚鵡熱嗜性衣原體菌株及其它衣原體菌株為陰性;重復(fù)性試驗中,變異系數(shù)為0.317%～0.563%;檢測靈敏性為0.01pg;Spike-test試驗中最低檢出量為25個 EB;該方法對禽鳥類糞便樣品的檢出率為14.3%(40/282),高于常規(guī)PCR檢測法的7.4%(21/282)。結(jié)論本文所建立的Taqman-M GB熒光定量PCR檢測法是一種靈敏、高效、穩(wěn)定,可在嗜性衣原體屬中準(zhǔn)確檢測鸚鵡熱嗜性衣原體的方法,該方法的建立更有意于今后對禽鳥類實施鸚鵡熱的臨床診斷與分子流行病學(xué)研究。

鸚鵡熱嗜性衣原體;熒光定量PCR;M GB探針;MOM P基因

鸚鵡熱嗜性衣原體(Chlam ydophila psittaci,C.psittaci)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原體,對鳥類、家禽和家畜有很強(qiáng)的感染性,可以通過接觸或吸入具有感染性禽類分泌物與排泄物而感染人類,從而引起非典型性肺炎與敗血癥以及結(jié)膜炎、心肌炎、腦膜炎等疾病〔1〕,被國際獸疫局列為二類傳染病〔2〕。近年來,隨著 PCR技術(shù)的迅速發(fā)展,熒光定量PCR技術(shù)有著靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于衣原體和嗜性衣原體的檢測中〔3〕。常用的熒光定量 PCR技術(shù)主要有染料法與探針法兩種,SYBR Green I和TaqMan探針法最為普遍,兩者相比,TaqMan探針法特異性和靈敏性俱佳,其中 TaqM an-M GB探針是一類新型3′端經(jīng)特殊處理的高特異性探針,能檢測模板結(jié)合區(qū)甚至1個堿基的突變基因,且本底熒光信號低,準(zhǔn)確率高〔4〕。本研究兼顧 TaqMan-M GB探針的特點,在鸚鵡熱嗜性衣原體主要外膜蛋白 (majo r outer memberane protein,MOM P)區(qū)建立了特異性TaqM an-M GB探針熒光定量 PCR檢測體系,并對昆明市282例禽鳥類糞便樣本進(jìn)行鸚鵡熱嗜性衣原體檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 鸚鵡熱嗜性衣原體菌株6株分別為:C.psittaci Bud-1,C.psittaci WC,C.psittaci NJ-1,C.psittaci Helijica,C.psittaci 6BC,C.psittaci Cal-10。非鸚鵡熱嗜性衣原體菌株6株:C.pneum oniae AR-39、C.pecorum IPA、C.pecorum M aeda、C.abortus B577、C.felis Fe/C-56、C.caviae OKM-2。衣原體菌株3株:C.trachom atis A/G、C.m uridarum Mo Pn、C.suis CS 0301。

上述菌株均由日本國立感染癥研究所Dr.kishimo to教授提供。

鸚鵡熱嗜性衣原體與衣原體菌株的培養(yǎng):應(yīng)用Hela229細(xì)胞繁殖(人宮頸癌上皮細(xì)胞系,A YCC CCL-2.1)購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 禽鳥類樣本 本研究用282例禽鳥類糞便樣本,采自云南省昆明市內(nèi)兩家動物園和5家花鳥寵物市場。

1.1.3 引物與探針設(shè)計 針對鸚鵡熱嗜性衣原體的外膜主蛋白(MOM P)的可變3區(qū)(VD3)的基因保守序列,設(shè)計引物及探針序列為 MOM PF:5-TGTGA TTCACAAACCAA GAGGCTA TA-3;

MOM PR:5-CGAGGCCTACTTGCCA TTCA-3;MOM P:(FAM)5-TA TGTTTAGGCA TCTAAAAC-3(M GB)。探針和引物均由美國 App lied Biosystem s(AB I)公司合成。

1.1.4 主要試劑和儀器 衣原體DNA提取試劑盒(美國 Gentra System s公司);禽類糞便DNA抽提試劑盒(美國 Q IAGEN公司);嗜性衣原體免疫熒光標(biāo)識單克隆檢測試劑盒(日本Denka生研株式會社);AB I 7500 real-time PCR儀(美國 App lied Biosystem s公司)。

1.2 主要方法

1.2.1 鸚鵡熱嗜性衣原體滴度測定 24孔板中制備單層 He1a 229細(xì)胞,以等量連續(xù)5～8個梯度10倍稀釋的鸚鵡熱嗜衣原體懸液感染細(xì)胞,每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后換新鮮培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h。按照嗜性衣原體的免疫熒光標(biāo)識單克隆抗體檢測試劑盒所規(guī)定的步驟進(jìn)行滴度測定。

1.2.2 DNA提取及熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件確立 鸚鵡熱嗜性衣原體菌株和糞便樣品的DNA提取嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。選擇56℃、58℃、60℃、62℃確定最適退火溫度,以矩陣法對引物濃度和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化,以期達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。

1.2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 將已知濃度的C.psittaci Bud-1菌株的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋成100 pg～0.01 pg五個濃度,根據(jù)反應(yīng)結(jié)果中樣品的分子數(shù)的對數(shù)值及其Ct值的對應(yīng)關(guān)系繪制出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 Taqman-M GB熒光定量PCR檢測體系的評價

1.2.4.1 檢測方法特異性 利用該檢測方法對鸚鵡熱嗜衣原體6株和非鸚鵡熱嗜衣原體及衣原體菌株的9株由來的DNA進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng),根據(jù)PCR反應(yīng)曲線和 Ct值確定該檢測方法的特異性。

1.2.4.2 檢測方法重復(fù)性 以 C.psittaci Bud-1菌株由來濃度分別為100 pg～1 pg的DNA作為模板進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng),計算每個稀釋度Ct值和拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)與變異系數(shù)(CV)。

1.2.4.3 檢測方法靈敏性 據(jù)分光光度計檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株 C.psittaci Bud-1的DNA濃度,將DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋成0.001 pg～100 pg六個濃度進(jìn)行 PCR反應(yīng)。以Ct值<37為下限判定該方法的靈敏性。

1.2.4.4 spike-test試驗 將標(biāo)準(zhǔn)菌株 C.psittaci Bud-1用 Hela 229進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),利用熒光標(biāo)識單克隆抗體檢測并確定其EB濃度,隨后調(diào)制成107～100個 EB,添加 200 m g鳥類的陰性糞便,提取DNA并進(jìn)行定量PCR測定。

1.2.5 檢測體系陽性結(jié)果的判定方法 熒光定量的結(jié)果以Ct值<37并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽性判定原則,其中Ct值<35且擴(kuò)增曲線良好可直接判定為陽性;Ct值在35～37之間需要重復(fù)3次實驗,兩次實驗均能得到良好擴(kuò)增曲線方可判斷為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立普通PCR在退火溫度60℃條件下擴(kuò)增條帶位置準(zhǔn)確,條帶清晰無非特異性擴(kuò)增,因此60℃為該檢測體系的最適退火溫度。總反應(yīng)體系25μL,2×Taqman universal 12.5μL,MOM P基因上下游引物濃度分別為 10μmol/L(各 2.25μL),探針濃度為5μmol/L(1.25μL),模板 DNA 5μL,用 ddH2O 補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為50℃2 m in 1個循環(huán);95℃10min 1個循環(huán);95℃15s,60℃1min,40個循環(huán),熒光采集信號設(shè)于60℃30s處。在上述條件下獲得的值Ct較小,而△R最大。

2.2 檢測體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)菌株C.psittaci Bud-1的DNA進(jìn)行十倍梯度稀釋成五個濃度,每個濃度設(shè)定3個平行試驗,進(jìn)行相應(yīng)的熒光定量PCR反應(yīng)。以熒光強(qiáng)度的對數(shù)值為橫坐標(biāo),循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示:Y=-3.377×log(X)+26.397,擴(kuò)增效率為97.7%,相關(guān)系數(shù)R2=0.999。由此可見本檢測體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率高,熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間相關(guān)性好,準(zhǔn)確性強(qiáng)。

圖1 鸚鵡熱嗜性衣原體Real time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of real-time PCR for C.psittaci detecting

2.3 檢測體系特異性評價 利用該檢測方法對15株鸚鵡熱嗜性衣原體與非鸚鵡熱嗜性衣原體及衣原體進(jìn)行檢測,圖2結(jié)果顯示,所有鸚鵡熱嗜性衣原體(每株樣品設(shè)定3個平行試驗)的MOM P基因檢測均呈現(xiàn)陽性,其它嗜性衣原體及衣原體的該基因檢測均為陰性。由此可見,該檢測方法對鸚鵡熱嗜性衣原體具有極佳的特異性。

圖2 鸚鵡熱嗜性衣原體Real time PCR檢測特異性Fig.2 Specificity test of C.psittaci real-time PCR 1.C. psittaci WC;2.C. psittaci Bud-1;3.C.psittaci Cal-10;4.C.psittaci 6BC;5.C.psittaci Helijica;6.C.psittaci NJ1

2.4 檢測體系的重復(fù)性評價 以鸚鵡熱嗜性衣原體10倍梯度稀釋的三個不同濃度的DNA為模板,對該檢測體系的重復(fù)性進(jìn)行評價,每個濃度采用5個平行試驗。通過對各濃度所對應(yīng)的Ct值的計算結(jié)果顯示,各濃度的平行試驗所獲得的Ct值之間的變異系數(shù)均小于1%(如表1所示)。由此可見,該檢測方法具有較好的重復(fù)性。

2.5 檢測體系的靈敏性評價 將DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋成6個濃度,隨后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),結(jié)果如圖3所示,該檢測體系的最低檢出量為0.01pg,與常規(guī) PCR方法的1pg相比〔5〕,其靈敏度高出100倍。由此可見,該檢測方法的檢測靈敏度較佳。

表1 熒光定量PCR檢測鸚鵡熱嗜性衣原體的MOMP基因重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1 Resultsof reproducibility for detecting MOMP gene of C.psittaci

2.6 Spike-test試驗分析 為了進(jìn)一步探討該檢測方法的臨床應(yīng)用性,由此實施了Spike-test試驗,具體結(jié)果如圖4所示,當(dāng)陰性糞便中加入250個 EB,隨后進(jìn)行DNA抽提,并將所抽提的DNA的十分之一供于該檢測體系進(jìn)行檢測,3次重復(fù)試驗結(jié)果均呈現(xiàn)陽性,其Ct平均值為36.8。由此可以判定,該檢測體系能夠應(yīng)用于臨床對鸚鵡熱嗜性衣原體進(jìn)行檢測,其最低檢測靈敏度為25個EB。

2.7 糞便樣品的檢測結(jié)果 應(yīng)用該檢測體系對采自云南省昆明市兩家動物園與5家花鳥寵物市場的282份禽鳥類糞便進(jìn)行了檢測,并與之前所報道的常規(guī)PCR檢測嗜性衣原體的方法進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,熒光定量PCR的檢出率為14.3%(40/282);而常規(guī)PCR的檢出率則為7.4%(21/282),由此可見,熒光定量PCR檢測明顯優(yōu)于常規(guī)PCR檢測法〔5〕。

3 討 論

嗜性衣原體屬包括鸚鵡熱嗜性衣原體(C.psittaci)、肺炎嗜性衣原體(C.pneumniae)、反芻動物嗜性衣原體(C.pecorum)、流產(chǎn)嗜性衣原體(C.abortus)、貓嗜性衣原體(C.felis)和豚鼠嗜性衣原體(C.caviae)〔6〕,其中肺炎嗜性衣原體屬于人源嗜性衣原體,其它五種均屬于動物源嗜性衣原體〔7〕。動物源嗜性衣原體廣泛分布于世界各地,引起動物和人的多種疾病,特別是鸚鵡熱嗜性衣原體和流產(chǎn)嗜性衣原體,可由動物傳染給人,導(dǎo)致嚴(yán)重的人獸共患性疫病(zoonotic infections)〔8〕。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,近年來聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的成熟,諸如 RT-PCR、巢式 PCR(nest-PCR)、雙重常規(guī)PCR等多種PCR檢測方法被廣泛應(yīng)用于衣原體的檢測,常規(guī)PCR檢測易出現(xiàn)交叉污染、假陽性率高、不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量等缺陷,而熒光定量PCR技術(shù)則具有實時監(jiān)測、精確定量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點,因此,近年來已被廣泛應(yīng)用于病原體的定性與定量檢測中。對于鸚鵡熱嗜性衣原體的檢測,大部分研究主要基于16S rRNA設(shè)計引物和探針〔9〕,由于該基因保守性極佳,因此是PCR反應(yīng)的理想目的基因,由此造成該基因很難區(qū)分嗜性衣原體,尤其是鸚鵡熱嗜性衣原體和流產(chǎn)嗜性衣原體。除此之外,Menard研究組〔10〕與 Alexandra Pantchev研究組〔11〕分別針對incA和om pA基因建立了鸚鵡熱嗜性衣原體TaqMan探針的熒光定量PCR檢測方法,但均不能很好區(qū)分 C.psittaci和 C.abortus。MOMP是衣原體表面的重要膜蛋白,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗衣原體中和抗體。利用MOMP基因設(shè)計引物和探針具有很高特異性,從而能更好地區(qū)分 C.psittaci與 C.abortus,吳東海等〔12〕和王爭強(qiáng)等〔13〕均針對MOMP基因建立了鸚鵡熱嗜性衣原體SYBR I的熒光定量PCR的檢測方法,該方法有靈敏性好、操作簡單、成本低等特點,但與 TaqMan探針法相比特異性差,假陽性率高。本研究利用的 TaqMan-MGB探針是近幾年研發(fā)的新型探針,與一般 Real-time PCR及 TaqMan探針相比,具備熒光本底低,分辨率更高,雜交穩(wěn)定性及特異性更強(qiáng),敏感度更高,結(jié)果更精確,可將探針的 Tm值提高10℃左右等優(yōu)點。該方法高特異性檢測鸚鵡熱嗜性衣原體能很好地區(qū)分C.psittaci和 C.abortus。至今國內(nèi)還未報道鸚鵡熱嗜性衣原體的 TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法,該方法的建立,填補(bǔ)了我國在該病原體臨床檢測技術(shù)上的空白。

為了進(jìn)一步評價該檢測體系在臨床上的應(yīng)用性,本研究設(shè)計了Spike-test試驗,對其臨床應(yīng)用性進(jìn)行了相應(yīng)的評價,其結(jié)果顯示,該方法對糞便樣本的最低檢出值為25個EB。本spike試驗設(shè)計為該檢測方法進(jìn)一步應(yīng)用于鸚鵡熱嗜性衣原體的臨床診斷與分子流行病學(xué)研究,以及在非典型性肺炎爆發(fā)時的臨床鑒別診斷提供了更為堅實可靠的科學(xué)保障。

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Developmen t and application of specific TaqMan-M GB probe quan titative fluorescence PCR assay for detection on Chlam ydophila psittaci

FENG Yue,ZHANG Zhong-hua,GONG Fu-ming,L IU Chen-jian
(Laboratory of A pp lied Microbiology,Faculty of L ife Sciences and Technology,Kunm ing University of Science and Technology,Kunm ing 650224,China)

In order to develop a specific,sensitive and repeatable quantitative fluo rescence PCR technology to detect Chlam y dophila psittaci,(C.psittaci)primers and specific TaqManminor-groove-binding(M GB)hybridization p robewere designed for identifying MOM P gene of C.psittaci.Then conditionsof PCR reaction were optimized,and the specificity,sensitivity,rep roducibility and Spike-test of the assay were evaluated.Besides,the examination results of clinic specimens from birds with bo th real-time PCR and conventional PCR methodswere compared.Themethod showed a strong linear relationship(R2=0.999)at a range of 0.01 pg-100pg and 97.7%PCR efficiencies;C.psittaci was detected by the assay specifically;the coefficients of variation(CV)value was 0.317%-0.563%and the sensitivity was 0.01pg;the detection limit of the assay in Spike-test was 25 EBs.Otherw ise,the positive coincidence rate(14.3%)from thismethod was higher than that(7.4%)from conventional PCR assay.It is evident that the quantitative fluo rescence PCR is a sensitive,efficient,and stablemethod for the detection of C.psittaci.

Chlam ydophila psittaci;quantitative fluorescence PCR;M GB p robe;MOM P gene

R379

A

1002-2694(2010)11-1041-04

＊云南省科技廳面上項目(KKSA 200926038)資助

柳陳堅,Email:new staar8@hotmail.com

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,昆明 650224

2010-05-28;

2010-08-31