許斌福,陳秀錦,劉曉東,林能鋒,劉新華,劉景瑜,林天龍

創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2株培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究＊

許斌福1,陳秀錦2,劉曉東1,林能鋒1,劉新華1,劉景瑜1,林天龍1

目的 探討創(chuàng)傷弧菌毒株FJ03-X2的優(yōu)化培養(yǎng)。方法以創(chuàng)傷弧菌毒株FJ03-X2進(jìn)行實(shí)驗(yàn),研究搖瓶培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)基、初始p H值、溶解氧等因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響,確定最適培養(yǎng)條件為:TSB培養(yǎng)基初始p H值為7.0,適宜接種量10%,培養(yǎng)溫度28℃,裝液量25mL/250mL,轉(zhuǎn)速180r/min。培養(yǎng)菌數(shù)可達(dá)8×109cfu/mL,生物量為25mg/m L。以 TSB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,采用單因子和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,確定最佳培養(yǎng)基主要成份為:葡萄糖0.2%、胰蛋白胨1.8%、大豆胨0.4%和玉米漿0.4%。以最佳培養(yǎng)基配方給菌體提供營養(yǎng),在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng),可以使培養(yǎng)液中的細(xì)菌生物量高達(dá)50mg/mL以上。結(jié)果得出創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2的優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方。結(jié)論國內(nèi)首次優(yōu)化鰻源創(chuàng)傷弧菌培養(yǎng)條件,并給出相關(guān)依據(jù)。

創(chuàng)傷弧菌;培養(yǎng);優(yōu)化

創(chuàng)傷弧菌(V ibrio vulnif icus)是一種低度嗜鹽性弧菌,屬于人魚共患病病原,能導(dǎo)致人與鰻鱺產(chǎn)生敗血癥和嚴(yán)重傷口感染〔1〕。上個(gè)世紀(jì)70-80年代,曾讓日本和歐美等國的鰻鱺產(chǎn)業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失〔2〕;近五年來,我國沿海地區(qū)養(yǎng)殖的鰻鱺因創(chuàng)傷弧菌而引起發(fā)病也十分嚴(yán)重,臨床上呈現(xiàn)急性和遷延性兩種過程,養(yǎng)殖鰻鱺的創(chuàng)傷弧菌病可反復(fù)發(fā)作,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。許斌福等〔3〕制備創(chuàng)傷弧菌ISCOM疫苗免疫鰻鱺預(yù)防創(chuàng)傷弧菌病,但疫苗的大規(guī)模研制必須面對(duì)高效培養(yǎng)的瓶頸問題,因此進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化研究具有重大意義。

目前,國內(nèi)外的創(chuàng)傷弧菌研究主要側(cè)重于流行病學(xué)和致病機(jī)理〔4〕等方面,比較少關(guān)注疫苗的研制與開發(fā),尤其是培養(yǎng)優(yōu)化方面。而細(xì)菌培養(yǎng)工藝研究主要集中在大腸桿菌等工業(yè)微生物〔5〕,弧菌培養(yǎng)工藝至今少見報(bào)道。因此,本研究選用了毒力較強(qiáng)、免疫原性好〔6〕的鰻源創(chuàng)傷弧菌 FJ03-X2,以 TSB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基優(yōu)化的研究,使培養(yǎng)液的活菌生物含量大幅提高,為創(chuàng)傷弧菌疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基 FJ03-X2菌株為本室保存的創(chuàng)傷弧菌;平板培養(yǎng)基 TSA(W/V)(p H7.0):大豆胨0.3%,胰蛋白胨1.7%,NaCl 1.5%,K2HPO40.25%,葡萄糖 0.05%,瓊脂 1.5%,0.7×105Pa濕熱滅菌20 min。

鑒別培養(yǎng)基TCBS瓊脂(購自杭州微生物試劑有限公司),取82g溶于1 000m L純水,加熱至完全溶解,冷卻至50℃,傾注無菌平皿備用。

種子(基礎(chǔ))培養(yǎng)基 TSB(W/V)(p H7.0):大豆胨0.3%,胰蛋白胨 1.7%,NaCl 1.5%,K2HPO40.25%,葡萄糖 0.05%,0.7×105Pa濕熱滅菌20 min。

1.2 培養(yǎng)方法 從新鮮鑒別培養(yǎng)基 TCBS接種一環(huán)單菌落于50m L種子培養(yǎng)基 TSB中,搖床(28℃,180r/min)培養(yǎng)16h;根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì),從種子瓶接種至培養(yǎng)液搖床(轉(zhuǎn)速180r/m in)培養(yǎng)后,測(cè)定結(jié)果。

1.3 分析方法 p H值的測(cè)定:梅特勒-特利多320型p H測(cè)定儀。

細(xì)菌計(jì)數(shù)和OD595值測(cè)定:平板培養(yǎng)基 TSA涂布法活菌計(jì)數(shù)和紫外分光光度計(jì)(上海天美UV 1102)測(cè)定 OD595值。

生物量的測(cè)定:稱量干凈離心管,取20m L培養(yǎng)液至離心管內(nèi)10 000 r/m in離心10m in,倒干上清液再稱重,由前后的質(zhì)量差與原體積之比即為生物量。

2 結(jié) 果

2.1 菌株中后期生長(zhǎng)曲線 采用平板涂布方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù) ,在培養(yǎng)時(shí)間 16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、72h各取一次樣。做出菌株的中后期生長(zhǎng)曲線如圖1所示。從圖1可知,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到20～28h左右時(shí),菌種生長(zhǎng)基本處于穩(wěn)定期,28h菌數(shù)峰值近80×108cfu/m L;32h之后細(xì)菌進(jìn)入衰老死亡期,72h菌數(shù)僅為1.25×106cfu/mL。

圖1 FJ03-X2菌株中后期生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of strain FJ03-X2

2.2 菌株數(shù)量與(10×)OD595的關(guān)系 稀釋菌液,分別測(cè)定菌液的(10×)OD595值與數(shù)量(108cfu/mL),得出活菌數(shù)量與(10×)OD595值的相關(guān)關(guān)系(圖2)。圖2顯示活菌數(shù)量與(10×)OD595值基本呈線性關(guān)系,添加趨勢(shì)線可以換算出細(xì)菌數(shù)量與(10×)OD595值之間的函數(shù)公式,函數(shù)公式為:y=0.0768x+0.0761,其中 y代表(10×)OD595值;x代表細(xì)菌數(shù)量(108cfu/m L)。

圖2 FJ03-X2活菌數(shù)量與(10×)OD595值的關(guān)系Fig.2 The curve of strain FJ03-X2 between quan tity and(10×)OD595

2.3 培養(yǎng)溫度 經(jīng)不同溫度培養(yǎng)細(xì)菌并進(jìn)行細(xì)菌性能試驗(yàn),結(jié)果顯示適宜培養(yǎng)溫度為28℃(另文報(bào)道)。

2.4 培養(yǎng)初始p H值 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 TSB組成不變的前提下,將培養(yǎng)基的初始p H值分別調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,然后接種培養(yǎng)。采用細(xì)菌(10×)OD595值間接測(cè)定培養(yǎng)液中的活菌含量,p H值對(duì)菌株FJ03-X2的影響如圖3所示。由此可知,該菌最適生長(zhǎng)p H值為7.0～7.5。

圖3 培養(yǎng)基pH值的確定Fig.3 The effects of pH value on the growth of strain FJ03-X2

2.5 接種量 在基本培養(yǎng)條件前提下,改變接種量,使接種量分別為 0.10%、0.50%、1.00%、5.00%、10.00%,采用(10×)OD595值間接測(cè)定培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)量。接種量與培養(yǎng)液細(xì)菌數(shù)量(10×)OD595值的關(guān)系如圖4所示,結(jié)果表明不同接種量對(duì)創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)影響不顯著,綜合考慮,適宜接種量為10%。

2.6 溶氧對(duì)生長(zhǎng)的影響 溶解氧是需氧菌培養(yǎng)的必備條件,搖瓶裝液量的多少直接影響氧的傳遞。本實(shí)驗(yàn)在基本培養(yǎng)條件前提下,改變裝液量,使裝液量分別為:200/500 m L(鋁箔和牛皮紙),200/500 mL(八層紗布),100/500 m L(鋁箔和牛皮紙),100/500 m L(八層紗布),50/250 mL(鋁箔和牛皮紙),50/250 m L(八層紗布);25/250 mL(八層紗布),然后接種培養(yǎng)。同樣采用(10×)OD595值間接測(cè)定培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)量。菌株FJ03-X2對(duì)氧氣的需求情況如表1所示。從表中可知,裝液量為25/250 mL(八層紗布)時(shí),培養(yǎng)液中的細(xì)菌(10×)OD595值最高;結(jié)果顯示,菌株FJ03-X2是需氧型。

圖4 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effects of inoculum size on the growth of strain FJ03-X2

表1 溶氧對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Tab.1 The effects of oxygen on the growth of strain FJ03-X2

2.7 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.7.1 碳源的優(yōu)化 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源葡萄糖分別配制為 0.05%(對(duì)照)、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%,制成培養(yǎng)基后接種培養(yǎng),用(10×)OD595值間接測(cè)定培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)量并測(cè)定p H值,結(jié)果見圖5。從圖中可以看出,細(xì)菌數(shù)量與產(chǎn)物p H值波動(dòng)趨勢(shì)幾乎完全一致,葡萄糖(p)對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)影響比較敏感,最適合創(chuàng)傷弧菌 FJ03-X2生長(zhǎng)的碳源是 0.2%葡萄糖;當(dāng)葡萄糖為 0.4%、0.8%、1.6%時(shí),培養(yǎng)液中的細(xì)菌(10×)OD595值明顯偏低、產(chǎn)物p H值也異常低。

2.7.2 氮源的優(yōu)化 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的胰蛋白胨分別設(shè)為 1.7%(對(duì)照)、1.2%、0.8%、0.4%和大豆胨0.6%、0.3%(對(duì)照)、0.15%以及 200%TSB(但氯化鈉保持1.5%);結(jié)果(見表2)顯示胰蛋白胨(y)和大豆胨(d)含量與細(xì)菌(10×)OD595值呈正相關(guān)關(guān)系;但200%TSB細(xì)菌(10×)OD595值不高,說明配方之間有比例因素。

圖5 碳源對(duì)培養(yǎng)的影響Fig.5 The effects of carbon on the growth of strain

表2 氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Tab.2 The effects of nitrogen sourceson the growth of strain FJ03-X2

2.7.3 無機(jī)鹽的優(yōu)化 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀分為 0.25%(對(duì)照)、0.1%、0.05%,細(xì)菌 (10 ×)OD595值分別為 0.555、0.547、0.533;結(jié)果顯示:不同濃度的碳酸氫二鉀的培養(yǎng)基培養(yǎng)FJ03-X2,細(xì)菌(10×)OD595值差異不明顯。

2.7.4 生長(zhǎng)因子的優(yōu)化 玉米漿和酵母膏均富含生長(zhǎng)因子,本實(shí)驗(yàn)是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加玉米漿和酵母膏,研究其對(duì)菌株 FJ03-X2的生長(zhǎng)促進(jìn)作用;試驗(yàn)分組為分別添加酵母膏 0.25%、0.10%、0.05%、玉米漿 0.25%、0.10%、0.05%、空白對(duì)照(未添加),細(xì)菌(10×)OD595值分別為 0.516、0.500、0.491、0.520、0.509、0.523、0.484;從結(jié)果可知,添加玉米漿(y)和酵母膏(j)均能促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng),細(xì)菌(10×)OD595值均比空白組(即未添加)顯著增加;酵母膏含量與細(xì)菌(10×)OD595值呈正相關(guān)關(guān)系,可能與酵母膏本身蛋白含量高也有關(guān)系;其中玉米漿的最佳添加量為0.05%。

2.7.5 正交實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)基中各組分之間有一定的內(nèi)在關(guān)系,為尋找它們之間最恰當(dāng)?shù)呐浔?在研究了碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等單因子對(duì)菌株FJ03-X2生長(zhǎng)的影響以后,采用正交實(shí)驗(yàn)的方法研究這些因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的綜合作用,以進(jìn)一步完善培養(yǎng)基中各組分的功能,提高培養(yǎng)液的生物量。以葡萄糖(0.18%、0.20%、0.22%)、胰蛋白胨(1.2%、1.5%、1.8%)、大豆胨(0.2%、0.4%、0.6%)和玉米漿(0.2%、0.4%、0.6%),磷酸氫二鉀 (0.15%、0.20%、0.25%)、氯化鈉(1.0%、1.5%、2.0%)、磷酸鐵 (0.0005%、0.001%、0.002%)和酵母膏(0.05%、0.1%、0.2%)作為培養(yǎng)因素,每個(gè)因素各選取三個(gè)水平,并按L9(34)正交表設(shè)計(jì)9組搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),每組做兩個(gè)平行。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表Tab.3 The resultsand statistic analysis table of orthogonal trial

由實(shí)驗(yàn)Ⅰ極差可知,A的極差最大,C的極差最小;由實(shí)驗(yàn)Ⅱ極差可知,D的極差最大,F的極差最小。極差越大,反映該因素水平變動(dòng)時(shí),總指標(biāo)變化越大,也就是該指標(biāo)對(duì)綜合指標(biāo)的影響越大。因此,按極差大小順序排列為A>B>D>C;H>G>E>F。據(jù)表2可知,菌株 FJ03-X2最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C2D2E2F3G3H3。并通過優(yōu)化 TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌生物量高達(dá)50 mg/mL以上;而對(duì)照組基礎(chǔ)TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)生物量約為25 m g/m L。

3 結(jié) 論

由實(shí)驗(yàn)可知,培養(yǎng)基的初始p H值、溶氧狀況和培養(yǎng)基的組成等對(duì)菌株的生長(zhǎng)有很大的影響。適合創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2菌株生長(zhǎng)的最佳條件是:培養(yǎng)基初始p H值為7.0,接種量10%(相對(duì)搖瓶裝液量),培養(yǎng)溫度28℃,裝液量25m L/250 mL。通過單因子分析和正交實(shí)驗(yàn),確定出創(chuàng)傷弧菌 FJ03-X2優(yōu)化培養(yǎng)基主要成分為:葡萄糖2g/L、胰蛋白胨18g/L、大豆胨4g/L和玉米漿4g/L。通過優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌生物量可實(shí)現(xiàn)翻番,為疫苗大規(guī)模生產(chǎn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。采用20L發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)24-28h,結(jié)果生物量可高達(dá)100-150 mg/m L。

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〔3〕許斌福,陳秀錦,俞伏松,等.創(chuàng)傷弧菌 ISCOM疫苗的免疫學(xué)效應(yīng)研究〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(11):1075-1078.

〔4〕吳斌,盧中華.創(chuàng)傷弧菌感染的致病機(jī)制研究現(xiàn)狀〔J〕.中國急救醫(yī)學(xué),2004,24(11):834-835.

〔5〕李寅,高海軍,陳堅(jiān).高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)〔M〕.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006,(6):229.

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Optim ization on fermentation of Vibrio vulnif icus FJ03-X2

XU Bin-fu,CHEN Xiu-jin,L IU Xiao-dong,L IN Neng-feng,L IU Xin-hua,L IU Jing-yu,L IN Tian-long
(Institute of B iotechnology,Fujian Academ y of A gricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

The effects of culture condition and media on the grow th of strain Vibrio vulnificus FJ03-X2 were studied in the experiment.The optimized fermentation conditions were as below:28℃,7.0 p H value of medium,10%inoculum size,50 mL medium per flask(250 mL),and 180r/m rotate.The optimized fermentation culture medium for strain FJ03-X2 was obtained after analyzing the effects on single elements of themedium(carbon sources,nitrogen sources,mineral and grow th facto r,respectively)for the grow th of strain and the relationship between each element.Themost optimal prescription for fermentation was composed of 0.2%glucose,1.8%tryp tone,0.4%soya pep tone and 0.4%co corn steep liquo r.The highest biomass concentration obtained in the experiments was above 50 mg/mL.

Vibrio vulnificus;fermentation;op timize

S941.42

A

1002-2694(2010)11-1008-04

＊國家863項(xiàng)目(2006AA 100308);福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2008N 0023);農(nóng)業(yè)部公益行業(yè)專項(xiàng)(nyhyzx07-043);福建省自然基金項(xiàng)目(2008J0057);福建省水產(chǎn)病害防治技術(shù)工程研究中心項(xiàng)目(2009N2003)

林天龍,Email:lint05@163.com

1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,福州 350003;

2.福建省疾病預(yù)防控制中心,福州 350001

2010-05-25;

2010-09-01