何沖霄 董曉鳴 姚立生 孫明法 梁國華

(1.鹽城市農業(yè)科學研究院，江蘇 鹽城 224002；2，鹽城生物工程高等學校，江蘇 鹽城 224002；3.揚州大學農學院，江蘇 揚州 225009)

水稻條紋葉枯病是當前江蘇等地區(qū)水稻生產上最嚴重的病害之一，對糧食安全和農民收入造成極大影響[1，2]。采用農業(yè)防治和化學藥劑等方法對水稻條紋葉枯病的控制效果有限，在重發(fā)地區(qū)，并不能阻止條紋葉枯病的持續(xù)流行，選育抗病品種才是從根本上控制水稻條紋葉枯病危害的主要途徑[3]，目前在生產上使用的抗病品種一般也表現(xiàn)較好抗性，但產量、米質方面存在或多或少的缺陷。所以培育既抗水稻條紋葉枯病又優(yōu)質高產的品種成為當前防治水稻條紋葉枯病的首要任務。但是通過傳統(tǒng)的育種方法要想選育抗性好、米質優(yōu)、產量高等集多個育種目標于一體的品種需要很長的育種年限。水稻條紋葉枯病抗性是由Stv-bi控制的，且已在第11染色體上精確定位，其連鎖標記在育種群體的親本之間具有多態(tài)性[4-7]。這使得抗水稻條紋葉枯病基因的分子標記輔助育種成為可能，目前這方面的報道較少見。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供體親本：鹽稻8號，含抗水稻條紋葉枯病基因，米質一般，產量潛力有限。

輪回親本：鹽稻9號，高產、優(yōu)質、不抗水稻條紋葉病。

親本和各世代中間材料見表1。

表1 親本和各世代中間材料

1.2 抗性基因的分子檢測

DNA提?。涸诿缙诟鞔郎y單株檢測分別掛牌編號，每株剪取幼葉7～8左右，用小量法(見附錄1)提取單株DNA,待測品系的檢測是每小區(qū)隨機取10株檢測。

分子標記檢測：本研究中應用的是與Stv-bi緊密連鎖的STS標記，其引物的設計及STS分析均在揚州大學植物功能基因組學教育部重點實驗室由梁國華教授指導完成。

PCR擴增反應體系包括：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、1.5U的Taq酶、4nmol dNTP、10pmol引物、20ng模板DNA。反應程序為：94℃預變性4min；94℃變性1min，50～60℃退火1min，72℃延伸1.5min，32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產物上樣于含EB(溴化乙錠)的3%瓊脂糖凝膠，以120V電泳2h，于紫外燈和BIORAD凝膠成像儀下觀察、讀數(shù)。

1.3 條紋葉枯病抗性鑒定

田間自然接種鑒定：選水稻條紋葉枯病重病區(qū)(鹽城建湖)做試驗田，從播種到成熟作不治蟲處理，利用田間的帶毒灰飛虱進行自然接種水稻條紋葉枯病毒，讓其自然發(fā)病。待病情發(fā)展穩(wěn)定之后，調查發(fā)病情況，本研究采用了兩個抗病性鑒定標準：一是株系發(fā)病率，即發(fā)生病癥的株數(shù)與總株數(shù)之比；二是病級指數(shù)，參照Washio的抗性鑒定標準得出數(shù)據(jù)[8-10]。

分子標記檢測鑒定：根據(jù)各回交世代分子標記檢測結果，決定下一代回交的母本單株，最后各品系的檢測結果與田間自然抗性結果對比，最終判斷各品系的抗性。

2 結果與分析

2.1 抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系的選育

用抗水稻條紋葉枯病品種鹽稻8號改良不抗病，但高產、優(yōu)質的鹽稻9號，自2005年夏的雜交配組開始，歷經三年6代的雜交、回交及人工選擇和分子標記輔助選擇，于2008年夏初步育成近似于鹽稻9號的抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系21個，世代為BC3F3。其中有5個品系田間對條紋葉枯病有較好抗性、產量及綜合農藝性狀比較理想，分別編為GK1、GK2、GK3、GK5、GK6，如圖1。

2005年鹽城鹽稻8號×鹽稻9號鹽稻8號為供體親本,鹽稻9號親本,得雜交種112粒?！?005年三亞F1×鹽稻9號雜種F1成苗33株,其中有8株為雜種,選一分蘗強的真雜交種與鹽稻9號雜交得雜種53粒?！?006年鹽城BC1F1×鹽稻9號雜種成苗23株,經分子檢測有5株含Stv-bi基因,5株中選編號為06GC1019號單株與鹽稻9號雜交得雜交種87粒?！?006年三亞BC2F1×鹽稻9號雜種成苗28株,經分子檢測有7株含Stv-bi基因,7株中選編號為06HG012號單株與鹽稻9號雜交得雜交種34粒?！?007年鹽城BC3F1成苗19株,經分子檢測有7株含Stv-bi基因,7株全部自交得7個株系種。田間編號為07G01、07G02、07G05、07G06、07G08、07G09、07G10?！?007年三亞BC3F2上代當選的7個株系每個株系種植400株,田間號分別為07HGF201、07HGF202、07HGF203、07HGF204、07HGF205、07HGF206、07HGF207。根據(jù)田間長勢淘汰了受低溫危害結實率偏低的4個株系,在株系田間號為:07HGF201、07HGF202、07HGF204的3個保留株系中分別選單株7個共計21個單株。↓2008年鹽城BC3F3當選的21個單株分別種成21個小區(qū),每小區(qū)4m寬1.3m。栽插規(guī)格20cm×20cm。

圖1抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系的選育過程

2.3 各品系的抗性鑒定

2.3.1大田自然接種鑒定。對同等條件下種植的21個品系進行水稻條紋葉枯病田間抗性調查，結果表明21個品系分屬上代的3個株系，其中GK1-7是07HGF21的后代，其抗性表現(xiàn)最好，除GK7是中抗外(分離)，其它6個均抗。另兩個株系07HGF22和07HGF24的后代中僅有一個品系是抗，其余均為感，見表2。

表2 2008年正季親本和個品系大田自然接種后對RSV的抗性表現(xiàn)

注：“*”表示當選品系，R為抗、MR為中抗、S為感病。

2.3.2分子標記檢測抗性。21個品系對不同引物的檢測結果并不完全一致，根據(jù)21個品系對6個引物的檢測匯總如表3，并選了其中的兩個電泳圖以供參考如圖2、3。表2、3顯示，GK1-GK7的7個品系(上代為07HGF21)與6個引物檢測，取得幾乎一致的結果，GK1-GK6全抗，GK7為分離(A29除外)。GK8-GK14的7個品系(上代為07HGF22)略有不同，其中GK8、GK9、GK12三個品系對不同引物檢測結果稍有不同。GK15-GK217個品系(上代為07HGF24)的檢測結果僅有GK15、GK20取得相同的結果，其它5個品系檢測結果都不一致。6個引物中A38與A36對所有品系的檢測結果完全一致，并且這個結果與大田自然抗性鑒定的結果相似程度最高，僅GK8和GK19不同，見圖2、表2。引物ZHSTS11-43與大田發(fā)病情況差別最大有6個品系的田間抗性與之不符，見表2、3。引物A31、A40分別有三個與大田不符，A29數(shù)據(jù)缺失過多無參考價值。

表3 21個粳稻新品系STS檢測結果

注：“0、1、2、3”分別表示數(shù)據(jù)缺失、感病、分離、抗病

P1P2 K1K21圖2 P1為抗病對照鹽稻8號,P2為感病對照鹽稻9號,標記為A36(STS標記)

P1P2 K1K21圖3 P1為抗病對照鹽稻8號,P2為感病對照鹽稻9號,標記為ZHSTS11-43(STS標記)

2.4 當選5個品系農藝性狀與鹽稻9號的比較

從苗期開始性狀觀察。將當選的21個品系與輪回親本(種植在同等肥力條件和相同栽培管理的試驗田中)作比較，總的看來，21個品系的田間表現(xiàn)明顯可分成三個大類每類7個，它們分別屬于上代的三個不同群體(見表2)。在苗期至分蘗盛期各株系與親本的表現(xiàn)差別不明顯;分蘗盛期之后各品系逐漸表現(xiàn)出與親本的差異，GK1-7株高明顯高于親本，抽穗期遲于親本3d，GK8-14株高與親本相似，抽穗期與親本相近，GK15-21株高比親本偏矮，抽穗期早3d左右。三個大類中差別較小，僅在株高和生育期，及芒的有無等方面有所不同。各品系內差別更小，但GK7品系內性狀尚有分離。

5個抗病品系農藝性狀與鹽稻9號室內考種結果的比較結果列于表4。輪回親本鹽稻9號因發(fā)病影響了產量，但株高和分蘗性及生育期等性狀仍比當選品系有優(yōu)勢。

表4 當選的5個抗病品系農藝性狀與鹽稻9號室內考種結果的比較

3 討論

用分子標記輔助選擇方法培育抗病品種是既高效又經濟的手段，它不受環(huán)境條件的影響，借助緊密連鎖的分子標記可以在植物生長的任何階段對抗性基因進行鑒定和選擇，而分析手段快速簡便，提高了選擇的效率，加快了育種進程。研究所用的分子標記準確可靠、操作方便，有很高的使用價值。個別數(shù)據(jù)與大田發(fā)病有出入可能是群體基因尚未純合一致導致的取樣誤差。

本研究用分子標記輔助選擇方法初步選育出了與親本相似，而抗性明顯優(yōu)于輪回親本的5個粳稻品系，說明利用分子標記輔助選育抗水稻條紋葉枯病粳稻新品系的方法是可行的。但是當選的5個品系雖然經歷了三年六代的單株系選，基本達到了集高產、優(yōu)質、抗病于一體的目標。但各品系間、品系內尚有分離，差別較大的親本存在多對基因的差異，為我們進一步篩選抗病的純合品系，提供了豐富的基礎材料。

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