賈玉臣，陳慶森

（天津商業(yè)大學 生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134）

乳源糖巨肽對小鼠IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用

賈玉臣，陳慶森

（天津商業(yè)大學 生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134）

研究了乳源糖巨肽（GMP）對健康Balb/c小鼠IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用，從細胞因子的角度探討了GMP維系機體健康的機制。對健康小鼠用GMP灌胃后，分別檢測一次灌胃GMP后12 h內(nèi)小鼠IFN-γ，IL-4每2 h的表達量的變化和連續(xù)5 d灌胃GMP對小鼠IFN-γ、IL-4的表達量，及IFN-γ/IL-4濃度比值的變化。結(jié)果表明，一次灌胃GMP短時間（12 h）內(nèi)可促進小鼠IL-4的表達，以灌胃后第6h的增加最為顯著，但對炎癥細胞因子IFN-γ沒有顯著性影響；連續(xù)5 d灌胃GMP可促進小鼠IL-4的表達，其中第3天和第4天的變化呈顯著性，對IFN-γ同樣無顯著性影響，因此第3天至第5天GMP組小鼠中的IFN-γ/IL-4的比其他兩組顯著降低。本研究提示了GMP具有調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡的功能。

乳源糖巨肽；GMP；Th細胞；細胞因子

0 引 言

1986年，Mosmann等[1]首先將CD4+T細胞分為Th1和Th2兩個亞群。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ，而Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13等細胞因子[2]。Th1/Th2平衡因與機體的多種免疫性疾病密切相關(guān)而影響著機體健康。Delfour等[3]于1965年在乳κ-酪蛋白中發(fā)現(xiàn)了含有唾液酸的多肽。牛乳中的κ-酪蛋白在凝乳酶作用下分解為兩部分：不溶性的副酪蛋白和可溶性的酪蛋白巨肽（Caseinomacropeptide,CMP）。GMP有諸多生物活性，比如抗微生物毒素[4]、促益生菌增殖[5]以及免疫調(diào)節(jié)[6]等活性，目前已有許多研究陸續(xù)地對GMP的免疫調(diào)節(jié)作用進行了初步探索[7]。本實驗分別研究探討了一次灌胃GMP后短時間（12 h）內(nèi)小鼠IFN-γ、IL-4的質(zhì)量分數(shù)變化和連續(xù)5 d灌胃GMP對小鼠IFN-γ、IL-4的含量及IFN-γ/IL-4比值的變化，從而探討GMP維系Th1/Th2平衡的功能。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Balb/c小鼠 （SPF級，雄性，體質(zhì)量（25±2）g）、小鼠常規(guī)飼料。

1.1.2 試劑及試劑盒

GMP（純度為70%，其中唾液酸質(zhì)量分數(shù)10%以上），IFN-γ ELISA試劑盒，IL-4 ELISA試劑盒，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

酶標儀，恒溫培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 GMP溶液的配制

準確稱取0.500 g GMP溶于80 mL無菌水中，定容至100 mL，得到5 g/L的GMP溶液。每天于灌胃前新鮮配制。

1.2.2 GMP灌胃劑量的選擇

根據(jù)本實驗室的前期研究，最終選擇給與小鼠的灌胃劑量為50 mg/kg。

1.2.3 一次灌胃后小鼠外周血清變化

（1）動物分組。Balb/c小鼠54只，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組，每組18只，（空白對照組、生理鹽水組和GMP組），空白對照組僅給與普通鼠食，生理鹽水組灌胃0.2 mL，GMP組灌胃劑量為50 mg/（kg·d）的GMP溶液。

（2）獲取血清樣本。將新鮮配制的GMP溶液按照50 mg/kg的劑量灌胃小鼠，分別于灌胃后第2，4，6，8，10和12 h進行眼眶靜脈叢取血1 mL，每次處理3只小鼠，所得血液4℃靜置過夜后，1 000 g離心15 min，得到血清，待測。

（3）IL-4和IFN-γ質(zhì)量濃度測定。利用用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測定IL-4和IFN-γ的質(zhì)量濃度，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 對小鼠連續(xù)5 d灌胃（GMP）變化情況

1.2.4.1 動物分組

Balb/c小鼠63只，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組，每組21只 （空白對照組、生理鹽水組和GMP組），空白對照組僅給與普通鼠食，生理鹽水組灌胃0.2 mL，GMP組灌胃劑量為50 mg/（kg·d） 的GMP溶液。

1.2.4.2 樣本獲取

將新鮮配制的GMP溶液灌胃小鼠，記為第1 d，于灌胃后分別拉頸處死每組中的3只小鼠，將其四肢和尾部固定在解剖臺上,打開腹腔沿胃部幽門向下找出全腸，將其置于事先消毒的潔凈載玻片上，在距幽門4 cm處取小腸約3 cm縱向剖開后用無菌PBS緩沖液將殘渣除去，準確稱取0.2 g于組織勻漿器中，再加入PBS緩沖液，將組織破碎，得到20%的組織勻漿，立即在Sigma離心機中4℃，5 000 g離心10 min，取上清液于-70℃冰箱中凍存。

連續(xù)灌胃5 d，每天處理同上，得到腸段組織勻漿上清液，凍存待測。

完成5 d灌胃后，改為正常鼠食飼喂至第6和7天，每天分別處死各組3只小鼠，上述同樣方法得到腸段組織勻漿上清液，凍存于-70℃超低溫冰箱中，待測。1.2.4.3IL-4、IFN-γ質(zhì)量濃度測定

利用用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測定IL-4和IFN-γ的質(zhì)量濃度，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析，處理結(jié)果用均數(shù)±標準差（x±S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 一次灌胃后血清中IFN-γ質(zhì)量濃度變化

細胞因子的合成與分泌是一個短促的、自我限量的過程，本研究檢測了GMP刺激后短時間（12 h）內(nèi)小鼠外周血清中IFN-γ的質(zhì)量濃度變化，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，在一次灌胃GMP的12 h內(nèi)，3組小鼠外周血中IFN-γ質(zhì)量濃度沒有明顯的變化規(guī)律，基本處于 （18.40±4.82）ng/L至 （35.23±12.47）ng/L之間，并且在每個實驗時間點上組與組之間的差異均不顯著（P﹥0.05）。

2.2 一次灌胃GMP后血清中IL-4質(zhì)量濃度變化

同樣地，本研究對一次灌胃GMP后短時間（12 h）內(nèi)小鼠外周血清中IL-4的質(zhì)量濃度變化如圖2所示。

由圖2可以看出，在一次灌胃GMP后的12 h里，GMP組外周血中IL-4的濃度與空白對照組和生理鹽水組相比，呈整體增加的趨勢。在灌胃后最初的4 h，GMP組與空白對照組以及生理鹽水組IL-4質(zhì)量濃度之間的差異不顯著；在灌胃6 h后，IL-4的質(zhì)量濃度增高至（6.01±0.73）ng/L，與空白對照組和生理鹽水組均表現(xiàn)出顯著性差異（P﹤0.05）。8 h后，GMP組與其他兩組IL-4濃度均保持在一個相對穩(wěn)定的水平上，接近3.0 ng/L，但GMP組均高于空白對照組和生理鹽水組。

2.3 IFN-γ的質(zhì)量濃度變化

連續(xù)5 d灌胃GMP后，小鼠小腸組織中IFN-γ的質(zhì)量濃度變化如圖3所示。

由圖3可以看出丑，實驗7 d內(nèi)空白對照組與生理鹽水組小鼠腸黏膜中的IFN-γ質(zhì)量濃度基本處于（404.7±72.4）ng/L至 （606.5±165.7）ng/L這一平穩(wěn)的范圍，連續(xù)灌胃GMP對GMP組小鼠腸黏膜中的IFN-γ無顯著影響（P＞0.05）。

2.4 IL-4的質(zhì)量濃度變化

連續(xù)5 d灌胃GMP后，小鼠小腸組織中IL-4的質(zhì)量濃度變化如圖4所示。

由圖4可以看出，7 d內(nèi)空白對照組與生理鹽水組小鼠腸黏膜中的IL-4質(zhì)量濃度基本處于一個相對平穩(wěn)的狀態(tài)，連續(xù)5 d給小鼠灌胃GMP期間 ，GMP組小鼠腸黏膜中IL-4的質(zhì)量濃度從灌胃第1天開始呈現(xiàn)增高趨勢，在第4天出現(xiàn)最高峰，并在第3天和第4天時與其他兩組呈顯著性差異（P＜0.05），分別高達（248.1±28.0）ng/L和（363.8±28.6）ng/L，第5天與其他兩組無顯著性差異（P＞0.05）。同時，停止灌胃GMP后的第5天和第6天，GMP組小鼠腸黏膜中的IL-4的質(zhì)量濃度與空白對照組與生理鹽水組均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 IFN-γ/IL-4比值的變化

IFN-γ/IL-4的比值可在一定程度上反應Th1/Th2平衡的變化，本研究在連續(xù)5 d灌胃GMP后，小鼠小腸組織中IFN-γ/IL-4比值的變化結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，7 d內(nèi)空白對照組與生理鹽水組小鼠腸黏膜中的IFN-γ/IL-4的比值基本處于一個相對平穩(wěn)的狀態(tài)，連續(xù)5 d給小鼠灌胃GMP期間 ，第4天至第5天GMP組小鼠腸黏膜中的IFN-γ/IL-4比值分別為（1.52±0.39）和（1.86±0.69），比其他兩組顯著降低（P＜0.05）。停止灌胃GMP后，GMP組小鼠結(jié)腸中IFN-γ/IL-4的比值其他兩組無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

乳源GMP是一種非常重要的乳源生物活性肽，本研究工作圍繞GMP的分離純化以及后續(xù)的生物學活性評價，已經(jīng)取得了一些成果[8-10]。目前人們已經(jīng)從不同的角度來探討GMP對機體健康的促進作用[11，12]，但極少有研究對作用機制進行有力的論證與探討。食品不僅為生命活動提供營養(yǎng)和能量，更重要的是食品可能通過調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)、信息傳遞網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)，從而控制著機體的健康和生命活動[13，14]。當體內(nèi)處于靜息狀態(tài)時，大多數(shù)T細胞在機體中處于非激活狀態(tài)，并不會產(chǎn)生一定量的細胞因子。但是它一旦受到外界刺激，初始T細胞就會按照不同的比例分化為Th1或Th2細胞，進而向兩大趨向分泌不同類的細胞因子，從而對免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)。Th1細胞或Th2細胞在不同條件下可能只是隨機表達幾種特定類型細胞因子中的一部分，如Th1分泌IFN-γ，而Th2就會分泌IL-4。 本文已成功地利用流式細胞術(shù)研究了GMP刺激對小鼠腸黏膜CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量的影響，證實了GMP可促進小鼠腸黏膜CD4+T淋巴細胞的增殖[11]。大量的研究表明由于目前尚無很好的區(qū)分Th1和Th2細胞亞群的表面標志物，因此只能根據(jù)細胞亞群分泌特征性細胞因子的不同來間接檢測Th1/Th2平衡[15]，已經(jīng)有研究利用IFN-γ/IL-4比值的變化來反應Th1/Th2平衡的變化[16,17]。本研究結(jié)果表明，灌胃小鼠GMP 12 h內(nèi)IL-4會出現(xiàn)明顯的增高趨勢，并在灌胃后第6 h與對照組呈現(xiàn)顯著性差異，而在實驗期間IFN-γ并未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢；在連續(xù)5 d灌胃GMP的實驗期間，GMP組小鼠在灌胃后第2天至第5天腸黏膜的IL-4質(zhì)量濃度明顯高于對照組和空白對照組，而IFN-γ在實驗期間也未表現(xiàn)出明顯的變化趨勢，從而使得在連續(xù)灌胃后的第2天至第5天GMP組的IFN-γ/IL-4比值較空白對照組與生理鹽水組均低，提示GMP可能具有下調(diào)Th1/Th2的潛在功效。總之，GMP對IFN-γ的影響是不顯著的，該結(jié)論與Requena等[18]近期的研究成果是一致的，更重要的是得到的GMP可促進抗炎細胞因子IL-4表達的結(jié)論為進一步研究GMP在腸道內(nèi)的抗炎機制提供了佐證。細胞因子在外界刺激的作用下變化非常迅速，而Th細胞的分化則需要幾天時間[19]。由此推斷GMP可能對Th細胞的分化具有一定的調(diào)節(jié)作用。

在不同的免疫應答和免疫性疾病中Th1和Th2的比例是不同的，而且正是這種比例的變化本身會引起相應的疾病，因此Th1和Th2平衡概念的提出就可以為一些疾病的診治提供一定的途徑。近些年的報道已經(jīng)表明，炎癥細胞因子和抗炎細胞因子的研究將大大推動了炎癥性腸病 （Inflammatory Bowel Disease,IBD），尤其是潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis,UC）發(fā)病機制的研究，有關(guān)IBD的發(fā)病機制現(xiàn)已從細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、腸道菌群等方面得以闡釋。余萬桂等[20]人已證實潰瘍性結(jié)腸炎小鼠外周血中的IL-4較正常組顯著降低，表明調(diào)控Th1和Th2平衡對解決相關(guān)炎癥性疾病的作用。本實驗結(jié)論對乳源生物活性肽與機體健康關(guān)系的研究與開發(fā)具有重要的價值，為GMP的通過調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)、信息傳遞的機制和代謝網(wǎng)絡(luò)等的深入研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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Regulation of bovine glycomacropeptide on IFN-γ and IL-4 cytokines of mice

JIA Yu-chen,CHEN Qing-sen
（College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China）

To explore the regulation of glycomacropeptide（GMP）on Th cytokines of mice and the mechanism of health maintenance by GMP.Methods：IFN-γ and IL-4 are important cytokines respectively secreted by Th1 and Th2 cells.Mice

GMP by oral gavage at the dose of 50 mg/kg（bw）d,then IFN-γ and IL-4 content in peripheral serum were assayed every 2 hours after the administration for 12 hours.In the following experiment,IFN-γ,IL-4 content and IFN-γ/IL-4 in gut mucosa were assayed every 1 d after continuous administration for 5 d.Results：IL-4 content in peripheral serum was up-regulated by GMP administration in 12 hours,and IL-4 content varied significantly at 6th hour,whereas IFN-γ content didn’t.Similarly,continuous administration of GMP for 5 d could up-regulate IL-4 content in gut mucosa with significant variation at 3th and 4th day,compared with IFN-γ which was not affected,therefore the ratio of IFN-γ/IL-4 were lower significantly from 3th to 5th day.It was suggested that GMP could regulate Th1/Th2 imbalance.

bovine glycomacropeptide,GMP,Th,cytokine

Q93-33

A

1001-2230（2010）11-0011-04

2010-08-30

國家自然科學基金資助項目（30771524）。

賈玉臣（1985-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、乳品質(zhì)量與安全。

陳慶森