任亞萍 孫 莉 毛庭枝 邵曉云 陳 筠 農(nóng)林琳

摘要: 目的:探討誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在雄性SD大鼠性成熟期睪丸中的表達(dá)變 化情況及意義。 方法:選取出生后5周?7周和10周的雄性SD大鼠各6只,左側(cè)睪丸行石蠟切 片,運用免疫組化ABC法觀察iNOS在雄性SD大鼠性成熟期睪丸中的表達(dá)變化情況。 結(jié)果:①出生后5周,iNOS睪丸間質(zhì)細(xì)胞陰性表達(dá)。②出生后7周,絕大部分生精小管斷面有精子發(fā)生 ,iNOS睪丸間質(zhì)細(xì)胞弱陽性表達(dá),精母細(xì)胞陽性表達(dá)。③出生后10周,iNOS睪丸間質(zhì)細(xì)胞 強(qiáng)陽性表達(dá),精母細(xì)胞陽性表達(dá)。結(jié)論:在雄性SD大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中,隨著性成熟發(fā)育iNOS的表達(dá)漸強(qiáng)。

關(guān)鍵詞:一氧化氮合酶;睪丸;大鼠;性成熟

中圖分類號: Q959.837;Q954.6;Q954.592 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A 文章編號: 1008-2409(2009)05-0841-03

The expression and significance of the iNOS in the sexual-maturity SD rats te stis/REN Ya-ping, SHUN Li, MAO Tin-zhi, et al.∥Depatment of Histology and Emb ryology, Guilin Medical College, Guilin 541004, China

Abstract:Objective: To explore the expression and significance of the inducible nitric ox ide synthase (iNOS) in the sexual-maturity male SD rats testis.Met h ods: Eighteen male SD rats born for 5 weeks, 7 weeks and 10 weeks were selectedw ith each 6 rats. Paraffin sections of the left testis were made and the expressi on of the iNOS in the testis of male SD rat was observed by immunohistochemicalABC method.Results: iNOS was expressed in Leydig cells of the testis, and thep ositive degree were(-), (++) and (+++) respectively in the 5-w, 7-w and 1 0 -w groups. iNOS was also expressed in some spermatocytes. Conclusion: With the d e velopment process of sexual maturation, positive expression of iNOS shows the tr end of increasing in the Leydig cells of sexual-maturity male SD rat.

Key words:iNOS; testis; SD rat; sexual maturity

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)作為體內(nèi)一種重要的第二信使,廣泛分布于雄性生殖系 統(tǒng)的各組織細(xì)胞內(nèi),其作用及機(jī)制的研究已取得很大進(jìn)展[1]。由于NO半衰期極短 ,一般主 要通過測定一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)的活性來認(rèn)識它。筆者已對內(nèi)皮 型NOS(eNOS)細(xì)胞色素P450(芳香化酶)在性成熟大鼠睪丸中的分布進(jìn)行了研究,本實 驗以雄性SD大鼠為研究對象,采用免疫組化ABC染色法,顯示誘導(dǎo)型NOS(iNOS)在 性成熟期前后的雄性SD大鼠睪丸間質(zhì)中表達(dá)的變化規(guī)律,為NO與人類生殖發(fā)育及相關(guān)病癥關(guān) 系的研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

一抗:兔抗大鼠iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶);二抗:生物素化山羊抗兔 IgG(北京博奧森生物工程有限公司提供)。

1.2 實驗動物及標(biāo)本制備

選用出生后21d雄性SD大鼠18只(本院動物中心提供,SPF級) ,室外喂養(yǎng)兩周,于生后5周?7周和10周各取6只,麻醉后取材,置睪丸于中性福爾馬林液( 甲醛濃度為36%)中固定,石蠟包埋,制成6μm厚的連續(xù)切片。1.3 方法

運用熱修復(fù)抗原程序:石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟,蒸餾水洗3次; 用0 .01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液電爐修復(fù)5~10 min,滴加抗原修復(fù)液I 5~10 min,0.1 mol/L (pH 7.4)PBS洗2~3次,每次2 min;滴加正常山羊血清封閉液20 min,甩去多余液體不洗,加稀 釋的一抗(1∶100)4℃過夜,0.1 mol/L (pH7.4)PBS洗3次,每次2 min,滴加生物素化山 羊 抗兔IgG室溫20 min,0.1 mol/L PBS洗3次,每次2 min,滴加試劑SABC,室溫20 min,0.1 mo l/L PBS 洗4次,每次5 min 。DAB顯色5~10 min。陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判斷

陽性表達(dá)的細(xì)胞胞質(zhì)被染成棕黃色,陰性表達(dá)的細(xì)胞胞質(zhì)不顯色。結(jié)果判 定按染色細(xì)胞的數(shù)量比(陽性/總體)和染色深度進(jìn)行半定量測定,染色細(xì)胞數(shù)量以每只大 鼠取3張切片,每張切片隨機(jī)取5個視野,計數(shù)每5個生精小管間的陽性間質(zhì)細(xì)胞數(shù)與本視野 所有間質(zhì)細(xì)胞數(shù)之比。染色細(xì)胞的數(shù)量記分規(guī)則:無著色細(xì)胞為0分;著色細(xì)胞少于整個組 織細(xì)胞數(shù)的1/3為1分;著色細(xì)胞數(shù)介于整個組織細(xì)胞數(shù)的1/3~2/3為2分;著色細(xì)胞數(shù)超 過整個細(xì)胞數(shù)的2/3為3分。細(xì)胞染色深度按顏色深淺記分為:0分,1分,2分,3分。判定 結(jié)果:二者相加除以2,0分陰性(-),0~1分弱陽性(+),1~2分陽性(),2~3分強(qiáng)陽性() 。

2 結(jié)果

2.1 出生后5周免疫反應(yīng)表達(dá)情況

偶見生精小管斷面有精子發(fā)生,iNOS睪丸間質(zhì)細(xì)胞陰性表達(dá)。

2.2 出生后7周免疫反應(yīng)表達(dá)情況

絕大部分生精小管斷面有精子發(fā)生, iNOS睪丸間質(zhì)細(xì)胞弱陽性表達(dá),部分精母細(xì)胞陽 性表達(dá)。

2.3 出生后10周免疫反應(yīng)表達(dá)情況

iNOS睪丸間質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá),部分精母細(xì)胞陽性表達(dá)。

2.4 iNOS的免疫組化結(jié)果

出生后5,7,10周的大鼠睪丸組織iNOS的免疫組化結(jié)果見圖1。

3 討論

雄性SD大鼠性成熟時間為出生后7~8周,本實驗所取材動物睪丸是出生后5,7和10周, 代表了雄性SD大鼠性成熟睪丸發(fā)育的重要階段。

本課題組早前的研究得知,出生后5周?7周和10周,相應(yīng)的睪丸間質(zhì) 細(xì)胞胞質(zhì)eNOS免疫反應(yīng)陽性,陽性程度為(?+和)。而本次實驗的結(jié)果為隨著性成熟 發(fā)育 iNOS在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)為(-?泛同)。eNOS 和iNOS同作為NO合成限速酶 ,在生長發(fā)育的同一階段呈現(xiàn)出不同的表達(dá),結(jié)合莘曉陶等[2]的研究, eNOS和iN 0S在牽 張成骨過程中互相制約對骨形成和骨改建起非常重要的調(diào)解作用,同理,睪丸組織中所表達(dá) 的eNOS和iNOS在雄激素的合成過程和生精細(xì)胞的增殖活動中也相互協(xié)調(diào),保證NO水平維持在 合適的濃度,進(jìn)而調(diào)控激素水平?引導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡。

有學(xué)者[3,4]在研究靜脈曲張大鼠睪丸組織中iNOS的表達(dá)時,指出iNOS過度表達(dá)是 導(dǎo)致不育的原因之一,主要影響了生精小管細(xì)胞的增殖過程,故iNOS表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)。 iN OS在胃癌?結(jié)腸癌組織中的發(fā)生?發(fā)展中也起重要作用[5],iNOS表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì) 胞增殖。 國內(nèi)學(xué)者[6,7]認(rèn)為一氧化氮具有促使生殖細(xì)胞凋亡的作用,而iNOS表達(dá)增加 可能是影 響細(xì)胞凋亡的重要因素。另有學(xué)者[8]指出iNOS的信使RNA(mRNA)在巨噬細(xì)胞的 高表達(dá), 說明睪丸內(nèi)源性NO的大量產(chǎn)生與巨噬細(xì)胞iNOS活性增高有關(guān)。而在男性不育的研究[9 ]中認(rèn) 為iNOS的高表達(dá)與肥大細(xì)胞指數(shù)相關(guān)。隨著大鼠生長發(fā)育其免疫機(jī)制也趨完善,巨噬細(xì)胞? 肥大細(xì)胞參與免疫活動的能力也漸增強(qiáng),本實驗結(jié)果顯示隨著性成熟發(fā)育 iNOS的表達(dá)漸強(qiáng) ,這正與前人研究[8,9]相吻合。

本實驗中發(fā)現(xiàn),iNOS在接近成熟期的精母細(xì)胞中有表達(dá),推測NO參與了初級精母細(xì)胞向次級 精母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程,亦或是精母細(xì)胞步入凋亡的標(biāo)志。但對其意義的研究還需進(jìn)一步展開 ,此將為后續(xù)實驗指明方向。

參考文獻(xiàn):

[1] ZINI A,O'BRYAN M K,SCHLEGEL P N.Nitric Oxide synthase activi ty in human seminal plasma[J]. Urology, 2001,58(1):85.

[2] 莘曉陶,吳巍,張志純.eNOS與iNOS在牽張成骨中的相┕匭匝芯縖J]. 中國口腔種植學(xué)雜志,2008,13(4):163-165.

[3] 楊最素,朱有法,俞建軍. 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在精索靜脈曲張大鼠睪丸中 的表達(dá)[J].解剖學(xué)雜志,2006,29 (6): 728-733.

[4] Türker K ksal I, Erdoru T, Gülkesen H ,et al.The potentialrole of induc ible nitric oxide synthase (iNOS) activity in the testicular dysfunction associa ted with varicocele: an experimental study[J].Int Urol Nephrol,2004,36(1):67 -72.

[5] 袁文清,彭必村,周學(xué)斌. 一氧化氮合酶?增殖細(xì)胞核抗原在胃癌中的表達(dá) 及其關(guān)系[J].臨床消化病雜志,2006,18(3):175-177.

[6] 同麗萍.一氧化氮對大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡作用的研究[J].臨床醫(yī)學(xué),2 006,19(10):1795-1799.

[7] 何志賢,董玉林,張志軍,等. 大鼠額葉損傷后細(xì)胞凋亡及iNOS的表達(dá)變 化[J].蘇州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2008,28(5):747-750.

[8] WEISSMAN B A,NIU E,G E R,et al.Paracrine modulation of andro gensynthesis in rat leydig cells by nitric oxide[J]. J Androl,2005, 26(3):369- 378.

[9] SEZER C,KOKSAL I T,USTA M F,et al.Relationship between mastcell and iNOS e xpression in testicular tissue associated with infertility[J].Arch Androl,20 05,51(2):149-158.

(收稿日期: 2009-07-15)

[責(zé)任編輯 王慧瑾 鄧德靈]