吳剛珂 李 楊，顏承農(nóng)

(荊州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434020)(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434020)

中性紅與牛血清白蛋白相互作用特征研究

吳剛珂 李 楊，顏承農(nóng)

(荊州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434020)(長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434020)

在模擬動物體生理?xiàng)l件和不同溫度下，用熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外可見吸收光譜法等研究了中性紅(Neutral Red，NR)與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的相互作用,證實(shí)了NR有很強(qiáng)地猝滅BSA熒光強(qiáng)度的能力。分別用Stern-Volmer方程、Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程和熱力學(xué)方程等處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到在25～43℃度時(shí)相互作用的生成常數(shù)KLB(平均值為4.250×104kJ/mol)、熱力學(xué)參數(shù)(ΔHθ、ΔGθ和ΔSθ的平均值分別為-6.432kJ/mol、-21.38kJ/mol和-48.68J/K)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(平均值為1.155)。

中性紅；牛血清白蛋白；熒光猝滅光譜；三維熒光光譜；紫外吸收光譜；熱力學(xué)參數(shù)

蛋白質(zhì)是由許多氨基酸聚合而成的生物大分子化合物，是生命的最基本物質(zhì)之一，它與營養(yǎng)、發(fā)育、遺傳、新陳代謝等生命活動等密切相關(guān)。白蛋白是主要的血清蛋白，它能和許多內(nèi)源、外源性物質(zhì)結(jié)合。一些小分子染料與蛋白質(zhì)結(jié)合，可引起染料或蛋白質(zhì)光譜特性的變化，因此應(yīng)用這些小分子染料作為研究蛋白質(zhì)的熒光探針，可以從分子水平上進(jìn)一步了解在其他分子的作用下蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化和相互作用的機(jī)理等[1,2]。NR(Netural Red，中性紅)是一種穩(wěn)定性比較好的有機(jī)染料。鄧世星等研究了NR與BSA之間的相互作用，但其試驗(yàn)結(jié)果顯得粗糙，對熒光猝滅性質(zhì)的判斷顯得證據(jù)不足[3]。筆者在25～43℃溫度范圍和試驗(yàn)條件下，掃描NR作用于BSA的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜，分別用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程等處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，證實(shí)了在試驗(yàn)條件下，NR與BSA可相互作用形成具有一定結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，作用力主要是氫鍵作用力和范德華力，得到了相互作用常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，為研究NR的染色機(jī)理，探討釋放到環(huán)境中的NR產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響等提供重要信息。

1 試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

1)儀器 LS-55型熒光分光光度計(jì)(美國PE公司)；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；恒溫水浴SYC-15型(南京桑力電子設(shè)備廠)。

2)試劑 NR (上海試劑三廠，分子式為C15H17N4Cl，摩爾質(zhì)量288.79，中文名為2-甲基-3-氨基-6-二甲氨基二氮雜蒽鹽酸鹽)儲備液：200μg/ml；NR工作液：30μg/ml；BSA(上海生物化學(xué)制劑廠)溶液：5.0×10-5mol/L；NaCl溶液：0.5mol/L；Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.40)。所用試劑均為分析純，水為二次去離子水，經(jīng)檢測均無熒光雜質(zhì)。

1.2試驗(yàn)方法

在10ml比色管中依次加入2.0ml NaCl(0.5mol/L)溶液、2.0ml Tris-HCL緩沖溶液(pH=7.4)和2.0ml BSA(5.0×10-5mol/L)溶液及0～3.5ml NR溶液，以二次去離子水定容；在波長λex=285nm、狹縫寬度分別為15nm和2.5nm、常壓、25、31、37和43℃下于250～500nm范圍內(nèi)掃描BSA的熒光猝滅光譜，在常壓和25℃時(shí)測定了體系的同步熒光光譜，三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜；分別獲得試驗(yàn)體系的相對熒光強(qiáng)度和吸光度等。

2 結(jié)果與討論

2.1NR對BSA的熒光猝滅光譜

曲線1～8的cNR/×10-5：0，0.5195，1.039，1.559，2.078，2.598，3.117，3.637mol/L；cBSA=1.0×10-5mol/L；cNaCl=0.1mol/L。 圖1 NR對BSA熒光猝滅光譜

1)熒光猝滅光譜 BSA分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能夠發(fā)射內(nèi)源熒光。當(dāng)激發(fā)光波長為285nm時(shí)，BSA熒光發(fā)射峰位置在347nm附近。隨著NR濃度增加，BSA的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律地降低，表明NR分子能夠與BSA發(fā)生相互作用進(jìn)而猝滅BSA的內(nèi)源性熒光。按試驗(yàn)方法分別掃描了25、31、37、43℃等溫度下BSA和BSA- NR體系的熒光猝滅光譜，25℃的BSA的熒光光譜和在NR作用下BSA的熒光猝滅光譜見圖1。

2)熒光猝滅作用描述 熒光猝滅作用可分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移猝滅等。在一般情況下，動態(tài)猝滅作用和靜態(tài)猝滅作用可用猝滅常數(shù)隨溫度的變化關(guān)系加以區(qū)分。對于動態(tài)猝滅作用，升高溫度將增加分子間的有效碰撞和加劇電子的轉(zhuǎn)移過程，熒光猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大；對于靜態(tài)猝滅作用，升高溫度將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，熒光猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小。動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅作用還可以分別用Stern-Volmer方程[2]：

(1)

和Lineweaver-Burk方程[3]：

(2)

2.2熒光猝滅作用性質(zhì)和相互作用力

1)相互作用的線性回歸方程和熱力學(xué)參數(shù) 由4個(gè)溫度下熒光強(qiáng)度變化的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別作出Stern-Volmer 曲線和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，如圖2所示。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)線性擬合得到直線方程、相關(guān)系數(shù)等(見表1)。

圖2 Stern-Volmer 曲線和Lineweaver-Burk曲線

溫度/℃Stern-Volmer方 程RLineweaver-Burk方 程R25I0F/IF=0.7236+8.915×104cNR0.9957(I0F-IF)-1=1.49×10-3+3.230×10-8c-1NR0.999931I0F/IF=0.6912+9.088×104cNR0.9948(I0F-IF)-1=1.51×10-3+3.444×10-8c-1NR0.999937I0F/IF=0.6503+9.417×104cNR0.9939(I0F-IF)-1=1.47×10-3+3.509×10-8c-1NR0.999643I0F/IF=0.6586+9.546×104cNR0.9946(I0F-IF)-1=1.61×10-3+4.051×10-8c-1NR0.9994

圖3 lnKLB～1/T圖

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，NR與BSA作用的焓變ΔH可看成一個(gè)常數(shù)，當(dāng)溶液比較稀時(shí)，KSV可視為相互作用的標(biāo)準(zhǔn)平衡常數(shù)[7]，根據(jù)式(1)和(2)可以求得相互作用的KSV、Kq和KLB，由Van’t Hoff等壓方程的不定積分式作圖可以求得ΔH(圖3)，由熱力學(xué)方程可求ΔGθ和ΔSθ等，見表2。

2)熒光猝滅作用性質(zhì)的判斷 由圖2和表1可以看出，NR對BSA作用的Lineweaver-Burk曲線的線性關(guān)系明顯優(yōu)于Stern-Volmer曲線的線性關(guān)系；KLB隨著溫度的升高而減??；動態(tài)猝滅作用的Kq值一般都小于2.0×1010L/(mol·s)。該試驗(yàn)體系的Kq值大于2.0×1010L/(mol·s)；相互作用的吉布斯自由能小于零，熒光猝滅常數(shù)KLB的均值達(dá)到4.250×104mol/L，說明它們之間的相互作用能自發(fā)進(jìn)行，且作用產(chǎn)物穩(wěn)定性良好。

表2 NR對BSA作用常量和熱力學(xué)參數(shù)

在波長差分別為60nm和15nm時(shí)的同步熒光光譜主要反映蛋白質(zhì)中Trp和Tyr氨基酸殘基的熒光光譜特征[5]，按照試驗(yàn)方法分別測得Δλ=60nm和Δλ=15nm時(shí)，BSA和BSA與NR作用的同步熒光光譜，如圖4(a)和4(b)。隨著NR濃度的增加，Trp和Tyr的發(fā)射波長均發(fā)生紅移；BSA、NR和BSA-NR體系的紫外-可見吸收光譜的吸收峰強(qiáng)度和吸收峰波長明顯有別(圖5)；這些都是BSA與NR作用生成新復(fù)合物的佐證。由此可以判斷NR對于BSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)熒光猝滅作用。

曲線1～8的cNR/×10-5：0，0.5195，1.039，1.559，2.078，2.598，3.117，3.637mol/L；cBSA=1.0×10-5mol/L;cNaCl=0.1mol/L。圖4 同步熒光光譜

3)相互作用力類型 小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、氫鍵作用力、范德華力和靜電引力等。Ross等[6]根據(jù)大量的試驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出了判斷生物大分子與小分子結(jié)合力類型和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律。根據(jù)此規(guī)律和表2所列數(shù)據(jù)，該試驗(yàn)體系的ΔSlt;0、ΔHlt;0，NR與BSA之間的作用力可能主要是氫鍵作用力和范德華力。

4)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合位點(diǎn) 生物大分子與小分子相互作用的結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和猝滅劑濃度C之間滿足:

根據(jù)偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)給能體與受能體之間的距離靠近約在7nm以內(nèi)，即有可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[8]。能量轉(zhuǎn)移效率和2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)基團(tuán)之間距離滿足:

其中，E為能量轉(zhuǎn)移效率；r為供能體和受能體之間的結(jié)合距離；R0為臨界能量轉(zhuǎn)移距離；φ為供能體熒光量子產(chǎn)率；J為供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體吸收光譜的重疊積分。試驗(yàn)測得BSA的熒光發(fā)射光譜和NR的紫外-可見吸收光譜有較大程度的重疊(見圖6)。由函數(shù)關(guān)系式求得BSA與NR分子之間的結(jié)合距離約為2.18nm。

2.3NR對BSA構(gòu)象的影響

三維熒光光譜能為人們提供更多BSA構(gòu)象變化的相關(guān)信息。在水溶液中，蛋白質(zhì)分子中的疏水效應(yīng)、各基團(tuán)之間的氫鍵作用和靜電作用力是穩(wěn)定和維持其二、三級結(jié)構(gòu)的重要因素。BSA主要由疏水作用力維持其空間結(jié)構(gòu)和疏水腔，幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在其圓筒形的疏水腔內(nèi)，它所處的微環(huán)境變化直接影響氨基酸殘基的最大熒光發(fā)射波長移位和熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱，導(dǎo)致其空間構(gòu)象的變化[9,10]。

圖8 BSA和BSA-NR體系的等熒光強(qiáng)度圖

按照試驗(yàn)方法掃描了BSA和NR-BSA體系的三維熒光光譜(如圖7)，繪制了等熒光強(qiáng)度圖(圖8)。由圖可比較NR作用BSA前后三維熒光光譜的變化，探討NR對BSA微環(huán)境和構(gòu)象的影響。在NR作用BSA后，在熒光發(fā)射光譜中BSA的Trp的峰位有明顯紅移；在圖7(a)中，當(dāng)BSA的濃度為5.0 ×10-5mol/L時(shí)，其峰頂?shù)南鄬晒鈴?qiáng)度和峰頂坐標(biāo)(IF,λex/λem)為(516.1,280.0/348.5)，在圖7(b)中，當(dāng)加入NR后，BSA峰頂?shù)南鄬晒鈴?qiáng)度和峰頂坐標(biāo)(IF,λex/λem)為(283.2,280.0 /346.0)，熒光強(qiáng)度降低了232.9，激發(fā)波長未移動,但發(fā)射波長藍(lán)移了2.5nm。加入NR后，BSA的相對熒光強(qiáng)度明顯減弱，峰坐標(biāo)波長亦有變化，說明NR與BSA作用后，Trp所處微環(huán)境的極性有所削弱，而Tyr所處微環(huán)境的極性有所增強(qiáng)；隨著NR濃度增大，BSA所處微環(huán)境的極性和疏水效應(yīng)發(fā)生了變化，肽鏈松散度增加，有利于氫鍵的重組，加上范德華力的作用，導(dǎo)致BSA原有的α-螺旋結(jié)構(gòu)可能部分或者大部轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)構(gòu)，形成了一種新的無序結(jié)構(gòu)[11,12]。

3 結(jié) 論

1) 由25～43℃溫度范圍內(nèi)體系的熒光猝滅光譜數(shù)據(jù)，得到了NR和BSA相互作用的生成常數(shù)KLB的平均值為4.250×104L/mol，熱力學(xué)參數(shù)ΔHθ、ΔGθ和ΔSθ的平均值分別為-6.432kJ/mol、-21.38kJ/mol和-48.68J/K，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的平均值為1.155，結(jié)合距離約為2.18nm。

2)熒光猝滅性質(zhì)主要是靜態(tài)猝滅，相互作用力主要是氫鍵力和范德華力，這有助于闡明NR的染色機(jī)理。

3)蛋白質(zhì)分子中的疏水效應(yīng)、各基團(tuán)之間的氫鍵作用和靜電作用力是穩(wěn)定和維持其二、三級結(jié)構(gòu)的重要因素。由同步熒光光譜和三維熒光光譜的特征可以看出，NR作用BSA后，BSA所處微環(huán)境的極性和疏水效應(yīng)發(fā)生了變化，肽鏈松散度增加，有利于氫鍵的重組，加上范德華力的作用，導(dǎo)致BSA原有的α-螺旋結(jié)構(gòu)可能部分或者大部轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)構(gòu)。

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[編輯] 洪云飛

O614

A

1673-1409(2009)03-N021-05

2009-05-13

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2005ABA067)。

吳剛珂(1962-)，男，2004年大學(xué)畢業(yè)，技師，現(xiàn)主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面的研究工作。