梅 平，劉 洋 劉 義 韓曉樂 孫曉紅 張業(yè)中

(長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)(長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 43007)(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)(西北大學(xué)化工系，陜西 西安710069)(長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

三氮唑類西佛堿與牛血清白蛋白相互作用的光譜法研究

梅 平，劉 洋 劉 義 韓曉樂 孫曉紅 張業(yè)中

(長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)(長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 43007)(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)(西北大學(xué)化工系，陜西 西安710069)(長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州 434023)

用熒光光譜及紫外吸收光譜方法，研究了一種三氮唑類西佛堿與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，分析了不同溫度下西佛堿對(duì)BSA的熒光猝滅作用。研究表明三氮唑類西佛堿對(duì)BSA有較強(qiáng)的熒光猝滅作用，西佛堿對(duì)BSA的熒光猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅。并根據(jù)修正的Stern-Volmer方程，計(jì)算了西佛堿與BSA間的結(jié)合常數(shù)Ka，根據(jù)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論求得了西佛堿與BSA間的結(jié)合距離r；用Van’t Hoff方程計(jì)算了熱力學(xué)參數(shù)，用三維熒光光譜研究了BSA構(gòu)象的變化和用分子對(duì)接方法研究了西佛堿與BSA的結(jié)合位點(diǎn)，熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明二者主要以氫鍵和范德華作用力結(jié)合。

西佛堿；牛血清白蛋白(BSA)；熒光猝滅；三維熒光光譜；分子對(duì)接

西佛堿是一類有甲亞胺基官能團(tuán)的化合物，研究表明這類化合物具有抗癌、抗炎、抗菌等生物活性，是一類有醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)應(yīng)用前景的化合物。血清白蛋白(SA)是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，作為許多內(nèi)源性和外源性化合物的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可與許多化合物分子發(fā)生相互作用。藥物分子進(jìn)入血液后不同程度地與血清白蛋白結(jié)合，可以控制藥物向受體釋放，避免藥物迅速代謝。藥物與血清白蛋白相互作用的研究是介于化學(xué)和生命科學(xué)之間的邊緣性課題，是化學(xué)生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。在分子水平上研究藥物分子和生物大分子的相互作用，探索藥物與蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)合特性，對(duì)于闡明藥物的作用機(jī)理和進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)以開發(fā)新藥具有理論和實(shí)踐意義[1]。筆者采用熒光光譜及紫外光譜研究了一種三氮唑類西佛堿衍生物3-巰基-4-(2,5-二氯苯基亞甲胺基)-5-乙基-1,2,4-三氮唑與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。計(jì)算了其與BSA 的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合距離、熱力學(xué)參數(shù)等，并用分子對(duì)接技術(shù)研究了其與BSA的結(jié)合位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1儀器與試劑

1)儀器 LS-55熒光光譜儀(美國(guó)PE公司)； UV-4802紫外可見分光光(尤尼科上海公司)； HS-4(B)智能恒溫水浴(成都儀器廠)。

2)試劑 牛血清白蛋白(BSA，純度gt;95%)，用pH7.4的PBS緩沖液配制，濃度為2.0×10-6mol/L，4℃保存；西佛堿(西北大學(xué)化工系提供)；其他試劑為分析純；試驗(yàn)用水均為二次去離子水。

1.2試驗(yàn)方法

1)熒光光譜法 測(cè)定不同研究體系溶液在不同溫度(298、304、310K)的熒光發(fā)射譜。

2)吸收光譜法 測(cè)定各溶液的吸收光譜及與牛血清白蛋白物質(zhì)的量之比為1∶1的藥物溶液的吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

c(BSA)=2.0×10-6mol/L；c(西佛堿)A-K: 0， 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20×10-7mol/L。圖1 西佛堿對(duì)牛血清白蛋白熒光光譜的影響 (T=298 K,λex=280nm)

圖2 不同溫度下西佛堿猝滅牛血清白蛋白熒光的Stern-Volmer關(guān)系圖

2.1熒光發(fā)射光譜及熒光猝滅機(jī)制

1)熒光發(fā)射光譜 蛋白質(zhì)分子中因含有3種芳香族氨基酸殘基——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而產(chǎn)生內(nèi)源熒光。熒光猝滅指任何降低樣品熒光強(qiáng)度的過程。圖1是系列不同濃度的西佛堿對(duì)BSA的熒光猝滅圖。從圖中可以看出，隨著西佛堿濃度的增加，BSA體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明西佛堿與BSA之間發(fā)生了結(jié)合作用，從而猝滅了BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。

2)熒光猝滅機(jī)制 熒光猝滅過程通常可以分為動(dòng)態(tài)猝滅作用和靜態(tài)猝滅作用。無論是單一的動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，其過程均遵守Stern-Volmer方程[2]：

F0/F=1+Ksv[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0為未加猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度；Ksv稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度。

由于動(dòng)態(tài)猝滅依賴于擴(kuò)散，溫度升高時(shí)溶液的黏度下降，分子的運(yùn)動(dòng)加速，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)增大，從而增大猝滅常數(shù)。反之，溫度升高可能導(dǎo)致基態(tài)配合物穩(wěn)定性下降，從而減小靜態(tài)猝滅的的程度，因此可以根據(jù)不同的溫度下的BSA的猝滅情況來區(qū)分猝滅類型。為了研究西佛堿對(duì)BSA的猝滅機(jī)理，筆者分析了不同的溫度條件(298, 304, 310K)下西佛堿對(duì)BSA的熒光猝滅情況(如圖2)。從圖中可以看出，直線的斜率隨著溫度的升高而下降，作線性回歸計(jì)算各個(gè)溫度下的猝滅常數(shù)，列于表1。表1中數(shù)據(jù)顯示，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)呈現(xiàn)規(guī)律減小，表明西佛堿與BSA的作用是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下西佛堿與牛血清白蛋白作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)

2.2西佛堿與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)

在靜態(tài)猝滅作用中，熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由修正的Stern-Volmer方程表示[3]：

(2)

式中，F(xiàn)0是不存在猝滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度；F0-F是加入猝滅劑后熒光強(qiáng)度的變化；Ka是結(jié)合常數(shù)；f為修正常數(shù)。

以F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]作圖可得一條直線，通過斜率和截距求出西佛堿與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka。圖3為不同溫度梯度(298、304、310K)下的西佛堿對(duì)牛血清白蛋白熒光猝滅的修正Stern-Volmer關(guān)系圖，計(jì)算的結(jié)果列于表2。

表2 不同溫度下西佛堿與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)

2.3西佛堿與BSA相互作用的結(jié)合距離

根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論[4]可以求出西佛堿在BSA上的作用位置與色氨酸殘基之間的平均距離。圖4為西佛堿與BSA的物質(zhì)的量之比為1∶1時(shí)，西佛堿的吸收光譜與BSA熒光發(fā)射光譜的重疊圖。將圖4中的重疊部分積分，可求出結(jié)合距離r=2.6nm。r在2～8nm之間，符合能量轉(zhuǎn)移理論，說明西佛堿與BSA之間通過有效的能量轉(zhuǎn)移而促使蛋白質(zhì)熒光猝滅的可能性很大。

2.4西佛堿與BSA的結(jié)合模式

藥物與生物大分子之間的作用力主要包括氫鍵、范德華力、靜電作用力及疏水作用力。通過測(cè)定藥物與蛋白作用的焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，可判斷二者之間的作用力類型。

通過公式：

(3)

以lnKa對(duì)1/T擬合可得到ΔH、ΔS，進(jìn)而由公式：

ΔG=-RTlnKa

(4)

求得吉布斯自由能變(ΔG)，數(shù)據(jù)見表3。

根據(jù)Ross[4]的報(bào)道，當(dāng)ΔHgt; 0、ΔSgt;0時(shí)，體系為疏水作用力；當(dāng)ΔHlt;0、ΔSlt;0時(shí)，體系為氫鍵或范德華力；當(dāng)ΔH≈ 0、ΔSgt; 0時(shí)，體系為靜電作用力。由計(jì)算結(jié)果(ΔHlt; 0、ΔSlt; 0)可知該西佛堿與BSA主要是以氫鍵和范德華力結(jié)合。

表3 不同溫度下西佛堿與牛血清白蛋白作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.5西佛堿對(duì)BSA構(gòu)象的影響

試驗(yàn)測(cè)定了在溫度298K時(shí)BSA的三維熒光光譜(圖5(a))和西佛堿∶BSA=1∶1時(shí)的的三維熒光光譜(圖5(b))，從峰的類別看:圖5(a)和圖5(b)中的2條逐漸升高的“山脊”形峰的共同特征是λex=λem(Δλ= 0),是瑞利散射線。圖5(a)中，2個(gè)熒光峰的峰頂坐標(biāo)(F,λex/λem)分別peak1(579.88, 280.00/ 358.21) , peak2(565.28, 220.00 /359.03) 。而圖5(b)中,當(dāng)加入與BSA的物質(zhì)量之比為1∶1的西佛堿后,兩峰坐標(biāo)(F,λex/λem)分別為peak1(320.05 ,280.00/357.50)，peak2(308.78,220.00/359.00)。相比較熒光強(qiáng)度分別降低259.83(peak1) 和256.50 (peak2) ,熒光發(fā)射峰位置并沒有明顯的紅移或藍(lán)移，表明西佛堿的加入沒有引起B(yǎng)SA構(gòu)象明顯的變化。

圖5 牛血清白蛋白的三維熒光光譜和牛血清白蛋白-西佛堿體系的的三維熒光光譜

2.6西佛堿在牛血清白蛋白上結(jié)合部位的確定

圖6 西佛堿與牛血清白蛋白相互作用的分子模擬

研究表明，牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)具有高度的同源性(∽80%)蛋白質(zhì)，且三維晶體結(jié)構(gòu)非常的類似。藥物主要與血清白蛋白的SiteⅠ和SiteⅡ位點(diǎn)結(jié)合，華法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)分別是SiteⅠ和 SiteⅡ位點(diǎn)的標(biāo)記物[5]。為了確定西佛堿與牛血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，筆者從PDB數(shù)據(jù)庫得到人血清白蛋白(HSA)的三維晶體結(jié)構(gòu)，以與華法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)的結(jié)合口袋為活性位點(diǎn)，用氨基酸殘基匹配的方法確定了牛血清白蛋白(BSA)的SiteⅠ和SiteⅡ位點(diǎn)。用SYBYL分子模擬和藥物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行西佛堿與牛血清白蛋白(BSA)的分子對(duì)接試驗(yàn)(圖6)，試驗(yàn)結(jié)果表明西佛堿在SiteⅠ和SiteⅡ位點(diǎn)都有結(jié)合，但主要結(jié)合位點(diǎn)在SiteⅠ結(jié)合位點(diǎn)。

3 結(jié) 論

1)試驗(yàn)表明西佛堿與牛血清白蛋白(BSA)有很強(qiáng)的相互作用，猝滅類型為西佛堿與BSA形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，在溫度(298、304、310K)下的結(jié)合常數(shù)分別是5.882×105L/mol，3.608×105L/mol，1.994×105L/mol。

2)熱力學(xué)參數(shù)ΔH= -69.328kJ/mol，ΔS= -122.228J/(mol·K)，可以得到作用力類型主要為氫鍵和范德華作用力。

3)根據(jù)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論求得了西佛堿與BSA間的結(jié)合距離r=2.6nm,三維熒光光譜表明西佛堿的加入沒有導(dǎo)致BSA構(gòu)象明顯的變化，分子對(duì)接試驗(yàn)表明西佛堿主要結(jié)合在BSA的SiteⅠ結(jié)合位點(diǎn)。

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[編輯] 洪云飛

O614

A

1673-1409(2009)03-N017-04

2009-06-08

中國(guó)石油科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2008D-5006-02-01)。

梅平(1961-)，男，1982年大學(xué)畢業(yè)，碩士，教授，現(xiàn)主要從事物理化學(xué)方面的教學(xué)與研究工作。