唐雪生，張先平 李 珩，劉 芳

(長(zhǎng)江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，荊州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 荊州 434000)

HPLC法測(cè)定結(jié)腸炎定位片中大黃素的含量

唐雪生，張先平 李 珩，劉 芳

(長(zhǎng)江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，荊州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 荊州 434000)

目的：研制結(jié)腸炎定位片，并建立HPLC法測(cè)定該制劑中大黃素的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Kromasil-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(88∶12)；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：36℃。結(jié)果：大黃素進(jìn)樣量在0.064～0.512μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：Y大黃素=2.504×103X+1.976，r=0.9997(n=5)；平均加樣回收率為100.35%，RSD為1.93%(n=5)。結(jié)論：HPLC方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于結(jié)腸炎定位片中大黃素的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；結(jié)腸炎定位片；大黃素；含量測(cè)定

結(jié)腸炎定位片[鄂藥制字(2001)第LZ07-003號(hào)]系湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬中醫(yī)院研制的一種結(jié)腸定位制劑，由金不換、黃連、白術(shù)、白芨、丹參等14味藥材制成，具有健脾益氣、清熱利濕、行氣止痛、活血化瘀之功效，臨床用于各種急慢性結(jié)腸炎的治療。經(jīng)該院多年臨床使用驗(yàn)證，療效較好。金不換為方中君藥，大黃素為其主要有效活性成分之一。為更好地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，保證其臨床療效，我們參考文獻(xiàn)[1～3]采用HPLC法對(duì)結(jié)腸炎定位片中大黃素的含量進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器LC-4A高效液相色譜儀，SPD-6A紫外檢測(cè)儀，C-R4A色譜工作站(日本島津)；高速離心機(jī)(美國(guó)MICRO12-24)。

1.2試藥大黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0756-200110)；結(jié)腸炎定位片(自制，規(guī)格：0.5g，批號(hào)：070307、070308、070309)；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水使用多效蒸餾水。

2 處方與制備

2.1處方金不換1.5kg、黃連0.8kg、黃芩1.5kg、白術(shù)1.5kg、茯苓1.5kg、澤瀉2.0kg、山藥1.5kg、白芨1.5kg、丹參2.4kg、陳皮1.2kg、木香1.0kg、吳茱萸0.5kg、赤石脂1.5kg、甘草0.6kg、硬脂酸鎂0.055kg、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPXL) 0.372kg、腸溶衣劑0.54kg，共制1 200片。

2.2制備方法陳皮、木香、吳茱萸三味藥水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油。藥渣與除山藥外的其它諸藥加水提取兩次，水提取液用乙醇沉淀，回收乙醇，濃縮至稠膏。山藥干燥粉碎成細(xì)粉，與稠膏混合干燥粉碎。加乙醇以12目篩網(wǎng)制粒，干燥、整粒。取以上顆粒，加揮發(fā)油、PVPXL、硬脂酸鎂混勻壓片,包腸溶衣。鋁膜罩泡包裝，12片/板，裝盒即得。

3 方法與結(jié)果

3.1色譜條件色譜柱：Kromasil-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(88∶12)；

流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：36℃。進(jìn)樣量：20μl。

3.2溶液制備

3.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的大黃素對(duì)照品4mg，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取10ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml含32μg大黃素的對(duì)照品溶液。

3.2.2供試品溶液的制備 取結(jié)腸炎定位片5片，除去薄膜衣層，研細(xì)，取細(xì)粉1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液。精密量取續(xù)濾液15ml，水浴蒸干，殘?jiān)铀?鹽酸混合(10∶1)溶液20ml溶解，置水浴中加熱水解1h，冷卻，移于分液漏斗中，用三氯甲烷強(qiáng)力振搖提取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，在水浴上蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，并定量轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心15min，分取上清液，即得供試品溶液。

3.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例和工藝，制成不含金不換的陰性對(duì)照品，再按供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

3.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別取“3.2.1”對(duì)照品溶液、“3.2.2”供試品溶液和“3.2.3”陰性對(duì)照溶液20μl，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可見，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同的色譜峰，而陰性對(duì)照色譜無(wú)相應(yīng)的色譜峰，表明處方中其它組分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

A為大黃素對(duì)照品；B為供試品；C為陰性對(duì)照；1為大黃素色譜峰。圖1 高效液相色譜圖

3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取“3.2.1”項(xiàng)下大黃素對(duì)照品溶液2、4、8、12、16μl，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，并以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y大黃素=2.504×103X+1.976，r=0.9997(n=5)，表明大黃素進(jìn)樣量在0.064～0.512μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.5精密度試驗(yàn)精密吸取“3.2.1”項(xiàng)下大黃素對(duì)照品溶液20μl，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得大黃素峰面積，RSD為1.34%(n=5)；再精密吸取“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液20μl，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得大黃素峰面積，RSD為1.35%(n=5)。結(jié)果表明，本方法精密度較好。

3.6重復(fù)性考察取同一批樣品(批號(hào)：070309)，共5份，按“3.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液20μl，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，RSD為1.37%(n=5)，表明本法重復(fù)性較好。

3.7穩(wěn)定性考察取同一供試品溶液各20μl，分別于配制后0、2、4、6、8、12h測(cè)定大黃素峰面積。結(jié)果，RSD為1.37%(n=6)，表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的同批樣品(批號(hào)：070307，含量為0.45mg/g)1.0g,共5份，分別精密加入大黃素對(duì)照品，按“3.2.2”項(xiàng)下方法處理后，照“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 3批樣品中大黃素含量測(cè)定結(jié)果

3.9結(jié)腸炎定位片中大黃素的含量測(cè)定取3批不同批號(hào)的樣品，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備共試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中大黃素的含量。每一批樣品測(cè)2次，取平均值，結(jié)果見表2。

根據(jù)3批樣品的測(cè)定結(jié)果，暫定每1g結(jié)腸炎定位片中含大黃素不少于0.45mg。

4 討論

方中金不換為蓼科土大黃(Rumex madaio Makino)[4]，清熱解毒、破瘀生新、消腫痛、止血標(biāo)本兼顧為君藥；黃連、黃芩合用清熱燥濕止痢，共為臣藥；白術(shù)、茯苓、山藥、澤瀉益氣健脾滲濕，達(dá)到脾旺濕除的作用；丹參祛瘀止痛、活血通經(jīng)，白芨收斂、生肌止血，佐以陳皮、木香、吳茱芋理氣消脹，使氣血同調(diào)、氣血暢行；赤石脂收澀止瀉；甘草調(diào)和諸藥。

經(jīng)提取試驗(yàn)證明，甲醇為溶劑，水浴加熱回流1h，可將結(jié)腸炎定位片中大黃素提取完全。

經(jīng)水解試驗(yàn)證明，加鹽酸水浴加熱回流水解1h，結(jié)合型大黃素可基本水解成游離型大黃素，用三氯甲烷提取4次，每次15ml，基本可提取完全。

在流動(dòng)相的選擇上，我們比較了甲醇-水、甲醇-水-醋酸、甲醇-0.1%磷酸溶液等不同組分和比例的流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸(88∶12)作為流動(dòng)相，分離效果最好。由圖1可見，在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，樣品中大黃素與其他組分分離良好，主峰位置與對(duì)照品色譜圖基本一致，且峰形對(duì)稱；陰性對(duì)照色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置處無(wú)色譜峰，表明處方中其他組分均不干擾大黃素的測(cè)定。

采用高效液相色譜法對(duì)制劑中的大黃素進(jìn)行含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性及回收率均理想，可以有效地控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

[1]王克英. HPLC測(cè)定土大黃中大黃素的含量[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2003，10(9)：34-35.

[2]徐選明，季瑛，劉新，等. 大黃中大黃素提取工藝的優(yōu)化[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(5)：423-424.

[3]王麗，張山川，徐珽，等. 高效液相色譜法測(cè)定咽炎顆粒中大黃素的含量[J]. 中國(guó)藥房，2007，18(9)：684-686.

[4]趙學(xué)敏. 本草綱目拾遺[M]. 上海：商務(wù)印書館，1954：256-258.

[編輯] 一 凡

2009-05-28

湖北省教育廳重點(diǎn)自然科學(xué)項(xiàng)目(D200662001)；荊州市科技局自然科學(xué)項(xiàng)目(200217E07-15)

唐雪生(1974-)，男，廣西藤縣人，主管藥師，從事臨床藥學(xué)工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.03.022

R917

A

1673-1409(2009)03-R046-03