陳敬涵 徐敏 吳愷 王興鵬

齊留通在急性壞死性胰腺炎腺泡細胞凋亡中的作用

陳敬涵 徐敏 吳愷 王興鵬

5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase, 5-LOX)是脂肪酸氧化代謝的重要酶類，近年的大量研究已經證實，5-LOX在許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中都起到重要作用。而關于急性胰腺炎(AP)時，5-LOX在胰腺腺泡細胞凋亡中作用的研究卻鮮有報道。本文旨在探討5-LOX抑制劑與AP腺泡細胞凋亡的關系和意義。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：選用無特殊病原體SPF級雄性SD大鼠54只(由中科院實驗動物中心提供)，體重180～240 g，隨機分為3組：假手術組、急性壞死性胰腺炎組(ANP組)和齊留通組，每組18只。參照Aho等[1]方法，經膽胰管逆行加壓注射5%?；悄懰徕c溶液(0.1 ml/100 g體重，12 ml/h)建立ANP模型。假手術組注射等容量生理鹽水，齊留通組造模前1 h給予齊留通100 mg/kg體重灌胃。于制模后6、12、24 h處死大鼠。

2．觀察指標及方法

(1)胰腺組織形態(tài)學改變：將各組大鼠胰腺組織的石蠟切片行HE染色，由病理科醫(yī)師單盲閱片，根據Schmidt等[2]標準進行胰腺組織鏡下病理評分。

(2)胰腺細胞凋亡測定：術后各時點取病變較為一致的胰腺頭部，固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，常規(guī)切片。應用TUNEL法檢測胰腺腺泡細胞凋亡，實驗步驟按說明書進行，每張切片隨即選擇5～10個高倍視野，計數(shù)1000個腺泡細胞中的凋亡細胞并用百分數(shù)表示，作為凋亡指數(shù)(AI)。

(3)凋亡相關基因caspase-3、bcl-2的mRNA表達水平測定：術后各時相取胰尾部組織凍存于液氮中備用，以Trizol法提取細胞總RNA，用半定量RT-PCR技術對轉錄產物進行擴增，以β-actin作為內參對照，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后拍照。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行電泳條帶密度分析，以靶基因的條帶密度/β-actin的條帶密度代表靶基因的表達水平。β-actin引物上游5′-TTGTCACCAACTGGGACGATATGG-3′ ，下游5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′，擴增長度217 bp；大鼠caspase-3引物上游5′-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3′，下游5′-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3′，擴增長度216 bp；bcl-2引物上游5′-CTTTGCAGAGATGTCCAGTCAG-3′， 下游5′-GTACTCAGTCATCCACAGAGGG-3′，擴增長度208 bp)。

二、結果

1．胰腺組織的病理改變：假手術組各時點胰腺組織結構均正常，細胞形態(tài)清晰。ANP組6 h肉眼觀胰腺明顯腫脹，色暗，少量腹水，呈淡紅色，光鏡下見腺泡散在的點狀壞死，周圍聚集許多炎癥細胞；12 h胰腺呈暗灰色或黑色，出現(xiàn)較多量的血性腹水，鏡下呈片狀壞死，大量炎癥細胞浸潤；24 h腹水量大，鏡下見胰腺組織廣泛壞死、溶解(圖1)。齊留通組6 h見胰腺組織中性粒細胞浸潤較ANP 6 h組明顯減少，有時可見到點狀壞死，12 h鏡下有局灶壞死及炎癥細胞浸潤，但是腺泡結構良好；24 h可見片狀壞死及脂肪溶解，但程度較ANP組24 h有所減輕(圖1)。齊留通組病理評分均低于ANP相應時點，12、24 h差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05，表1)。

2．胰腺細胞的凋亡：假手術組極少見到細胞凋亡，ANP組6、12、24 h的凋亡指數(shù)分別為(2.33±0.19)%、(4.93±0.33)%、(7.87±0.40)%，均較假手術組高，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)；齊留通組6、12、24 h的凋亡指數(shù)分別為(2.42±0.25)%、(10.62±0.60)%、(9.50±0.26)%，均高于相應ANP組，但是兩者在6 h的差異無統(tǒng)計學意義，12、24 h均有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05，圖2)。

表1 各組胰腺組織病理評分

注：與假手術組比較，aPlt;0.05；與ANP相應時點比較，bPlt;0.05

圖1ANP組(A、B、C：6、12、24 h)和齊留通組(D、E、F：6、12、24 h)胰腺組織病理改變(HE ×400)

3．caspase-3、bcl-2 mRNA的表達：假手術組胰腺組織有較少的caspase-3、bcl-2 mRNA表達，ANP組各時點表達水平較假手術組均有所升高，且差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05，表2)；齊留通組各時點caspase-3 mRNA表達水平均高于ANP組，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)，bcl-2 mRNA表達水平均低于ANP組，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05，圖3，表2)。

圖2 各組大鼠胰腺組織腺泡凋亡指數(shù)變化

圖3ANP組和齊留通組胰腺組織caspase-3、bcl-2 mRNA表達(1、3、5泳道為ANP組6、12、24 h；2、4、6泳道為齊留通組6、12、24 h)

討論近年的研究證實，白三烯類(LTs)是AP病程中一種重要的炎性介質，而5-LOX是LTs產生的限速酶。近年來大量研究證實， 5-LOX可以抑制癌細胞凋亡[3-6]。

本研究觀察ANP大鼠胰腺組織中的細胞凋亡情況及凋亡相關基因caspase-3和bcl-2 mRNA表達水平，以了解在ANP中5-LOX是否影響腺泡細胞的凋亡，從而影響胰腺組織的病理改變。

一直以來都認為在ANP中，腺泡細胞的主要死亡形式是壞死，而凋亡僅僅被認為可以間接地導致器官的萎縮。1995年Kaiser等[7]報道在4種ANP模型中都出現(xiàn)了大量壞死的胰腺細胞，卻很少有凋亡細胞，而急性水腫型胰腺炎模型中僅有少量壞死細胞，卻有大量凋亡細胞。除此之外，一些研究人員已經證實誘導凋亡可以降低實驗性胰腺炎的嚴重程度[8-9]。Takeyama等[10]報道，胰腺腺泡細胞凋亡在ANP的發(fā)病機制及其病程中發(fā)揮重要作用，適度的細胞凋亡對ANP時的胰腺腺泡具有保護作用，有目的促進腺泡細胞選擇凋亡的方式死亡，而不是以壞死的方式死亡，可以減輕AP的嚴重程度。這說明ANP嚴重程度與細胞凋亡呈負相關，腺泡細胞凋亡可能是對胰腺損傷的有利反應，對AP是一個有利的保護性機制。

表2 各組胰腺組織caspase-3、bcl-2 mRNA的表達

注：與假手術組比較，aPlt;0.05；與ANP相應時點比較，bPlt;0.05，cPlt;0.01

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，假手術組極少看到細胞凋亡，ANP組和齊留通組看到明顯的細胞凋亡，而且ANP大鼠使用齊留通干預后，每個時點的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡都明顯多于ANP組，炎癥細胞的滲出和細胞壞死也明顯減少，胰腺病變減輕。本實驗還選取了測定胰腺組織促凋亡基因caspase-3和抑凋亡基因bcl-2的mRNA的表達，結果顯示，齊留通組的caspase-3 mRNA表達明顯高于ANP組，而bcl-2 mRNA表達明顯低于ANP組，提示5-LOX抑制劑齊留通可以通過誘導胰腺腺泡細胞凋亡，進而減少腺泡細胞壞死，減輕胰腺細胞及組織損傷的程度，從而為其成為AP的輔助治療提供一定的理論依據。

[1] Aho HJ,Koskensalo SM,Nevalainen TJ.Experimental pancreatitis in the rat.Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis.Scand J Gastroent,1980,15:411-416.

[2] Schimidt J,Lewnadrowski K,Fernander-del Castillo C,et al.Histopathologic correlates of serum amylase activity in acute experimental pancreatitis.Dig Dis Sci,1992,37:1426-1433.

[3] Zhou GX,Ding XL,Huang JF,et al.Suppression of 5-lipoxygenase gene is involved in triptolide-induced apoptosis in pancreatic tumor cell lines.Biochim Biophys Acta,2007,1770:1021-1027.

[4] Hennig R,Ding XZ,Tong WG,et al. 5-Lipoxygenase and leukotriene B(4) receptor are expressed in human pancreatic cancers but not in pancreatic ducts in normal tissue.Am J Pathol,2002,161:421-428.

[5] Tong WG,Ding XZ,Adrian TE.The mechanisms of lipoxygenase inhibitor-induced apoptosis in human breast cancer cells.Biochem Biophys Res Commun,2002,296:942-948.

[6] Tong WG,Ding XZ,Witt RC,et al.Lipoxygenase inhibitors attenuate growth of human pancreatic cancer xenografts and induce apoptosis through the mitochondrial pathway.Mol Cancer Ther,2002,1: 929-935.

[7] Kaiser AM,Saluja AK,Sengupta A,et al.Relationship between severity, necrosis, and apoptosis in five models of experimental acute pancreatitis.Am J Physiol,1995,269:C1295-C1304.

[8] Bhatia M,Wallig MA,Hofbauer B,et al.Induction of apoptosis in pancreatic acinar cells reduces the severity of acute pancreatitis.Biochem Biophys Res Commun,1998,246:476-483.

[9] Hahm KB,Kim JH,You BM,et al.Induction of apoptosis with an extract of Artemisia asiatica attenuates the severity of cerulein-induced pancreatitis in rats.Pancreas,1998,17:153-157.

[10] Takeyama Y.Significance of apoptotic cell death in systemic complications with severe acute pancreatitis.J Gastroenterol,2005,40:1-10.

2008-09-29)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.020

200080 上海，上海市第一人民醫(yī)院消化內科(陳敬涵、徐敏、吳愷)；上海市第十人民醫(yī)院(王興鵬)

徐敏，Email:zhengxu19721973@yahoo.com.cn