鄧　昌

摘 要：目的：探討三七總皂甙對局灶性腦缺血再灌注損傷的海馬神經(jīng)生長因子及酪氨酸激酶A含量變化的影響。方法：120只SD大鼠體重200~220g，隨機分為3組：假手術(shù)組(n=40)，局灶腦缺血再灌注組(n=40)和三七總皂甙治療組(n=40)。線栓法制備大腦中動脈梗阻（MCAO）模型，藥物組在腦缺血再灌注即刻和12h腹腔注射三七總皂甙，模型組和假手術(shù)組均注射等量生理鹽水。分別在缺血再灌注2h、4h、6h、12h和24h處死動物，運用RT—PCR技術(shù)檢測缺血側(cè)海馬組織內(nèi)NGF和TrkA的mRNA的表達變化。結(jié)果：再灌注損傷后，損傷側(cè)海馬組織內(nèi)NGF和TrkA的mRNA表達均增高。在三七總皂甙治療組中NGF和TrkA的mRNA于再灌注2h上升，4h達高峰。結(jié)論：腦缺血后損傷側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)NGF和TrkA的mRNA含量增多，可能有利于受損神經(jīng)元的修復。

關鍵詞：局灶性腦缺血再灌注；三七總皂甙；神經(jīng)生長因子；酪氨酸激酶A

中圖分類號：R322.81文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）02-0026-03

現(xiàn)代藥理研究證實三七皂苷對多種動物腦缺血及再灌注損傷有良好的保護作用，其作用機理與鈣離子拮抗及抗自由基等作用有關，同時三七皂苷還具有降低血粘度、抑制血小板聚集、擴張血管、降低血脂、改善學習記憶功能及改善微循環(huán)和抗炎等作用［1，2］。

本研究擬用大鼠大腦中動脈線栓法建立缺血模型，采用RT-PCR技術(shù)，檢測海馬組織內(nèi)NGF及TrkAmRNA含量的變化，并研究三七總皂甙對大鼠大腦中動脈栓塞后腦內(nèi)NGF及TrkA含量變化的影響來闡明其對缺血性腦損傷的神經(jīng)元保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

成年SD大鼠，雌雄各半，體量220～250g，由昆明醫(yī)學院實驗動物中心提供。三七總皂甙注射液(批號：ZZ-5559，商品名：腦明注射液)。TRIZOL試劑（Molecular Research Center），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Company)，PCR試劑盒PCR Master Mix Kit（Fermentas Company），DNA Ladder Marker 2000，DNA上樣緩沖液(大連寶生物)，TRIZOL(Molecular Reseach Center)。兔抗NGF多克隆抗體(Chemicon)，兔抗TrkA多克隆抗體(博士德生物工程有限公司)， 二步法免疫組化檢測試劑盒PV-9000(北京中杉)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

隨機分成3組：假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、三七總皂甙治療組(PNS組).每組根據(jù)再灌注時間不同再分為2h、4h、6h、12h和24h 5個亞組，每亞組8只動物。

1.2.2 模型制作

參考Longa［3］的線栓法，造成右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的缺血；2h后拔出線栓恢復再灌注，并縫扎切口。假手術(shù)組僅分離血管而不插線栓。三七組在拔出線栓后立即經(jīng)腹腔注射皂苷注射液(2mL ip)，隨之每隔12h用藥1次［5］。缺血再灌注組及假手術(shù)組注射相當劑量的生理鹽水。

1.2.3 RT-PCR技術(shù)檢測

實驗動物在術(shù)后各時間點，活體取損傷側(cè)腦皮質(zhì)組織約100mg，TRIZOL試劑提取總RNA。取4μg的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作按照試劑盒說明書進行，反應條件是94℃ 45s，退火溫度見表1所示45s，72℃ 1min，各基因的引物序列、最佳退火溫度及擴增產(chǎn)物大小如下表所示，引物由大連寶生物公司合成。PCR產(chǎn)物取20μL用含0.5μg/mL EB的1%瓊脂糖凝膠電泳，BIO-RAD凝膠成像儀紫外模式下分析凝膠圖片。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

組內(nèi)比較采用單因素方差分析；各組間的比較采用t檢驗。統(tǒng)計軟件選用SPSS 11.5。

2 結(jié)果

2.1 NGF和TrkA在各組中mRNA的表達變化

2.1.1 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性

RNA樣品1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳條帶，可見28S、18S條帶，說明所提取RNA樣品完整，可以用于逆轉(zhuǎn)錄(圖1)。

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的結(jié)果

在各組中均有β-actin、NGF和TrkA mRNA的表達，得到目的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察到特異性擴增條帶，大小分別為227 bp、479bp和824bp，與預期的片段長度一致（見圖2~4）。

圖例說明：1：DL2000 DNA Marker；2：再灌組2h組；3：再灌組4h組；4：再灌組6h組；5：再灌組12h組；6：再灌組24h組

2.1.3 圖片灰度掃描結(jié)果

對圖片進行灰度掃描。以β-actin灰度值為參照，求得各組的NGF和TrkA與β-actin的相對比值。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示（見表2）。結(jié)果顯示：再灌注損傷后，海馬組織內(nèi)NGF和TrkA的mRNA表達均增高，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在三七總皂甙治療組中NGF的mRNA于再灌注2h上升，4h達高峰，與假手術(shù)組和缺血再灌注組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而缺血再灌注組NGF的mRNA于再灌注6h達到高峰。TrkA mRNA的表達在灌注2h也明顯升高，同時也在4h達到高峰（P<0.05），與假手術(shù)組和缺血再灌注組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而缺血再灌注組TrkA的mRNA亦于再灌注6h達到高峰。

3 討論

NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，神經(jīng)營養(yǎng)因子不僅調(diào)節(jié)發(fā)育過程中神經(jīng)元的存活，而且能夠阻止成年神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元的死亡等許多神經(jīng)系統(tǒng)功能。高親和力NGF受體trkA被公認為是NGF的功能性受體，是啟動傳遞NGF生物效應的信息物質(zhì)。當NGF與trkA結(jié)合后，受體細胞外區(qū)構(gòu)象變化，使受體細胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶活性增強。其作用途徑，首先可通過提高神經(jīng)元表面的NGF受體TrkA的表達［4］，對神經(jīng)元產(chǎn)生生物效應；還可以通過活化NGF受體TrkA，在細胞內(nèi)阻斷損傷因子［5］，從而保護神經(jīng)元免受缺血性損傷，縮小梗死體積，且促進損傷后神經(jīng)組織的修復，減輕和改善患者癥狀。

三七總皂苷是從我國名貴中藥三七中提取的有效活性成分，能改善微循環(huán)、抗炎、抑制NO、興奮性氨基酸和脂質(zhì)過氧化等，可能還與NGF的表達增加有關。研究表明［6］：NGF、TrkA對維持損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)、促進神經(jīng)生長和修復具有重要作用，腦缺血損傷后應用外源性神經(jīng)營養(yǎng)不僅可減輕神經(jīng)元損傷，而且可促進運動、感覺軸突再生和神經(jīng)功能的恢復。

短暫的全腦缺血過程能引起海馬CA1區(qū)錐體細胞在缺血后數(shù)天發(fā)生死亡，而頂葉皮層，海馬CA3區(qū)和齒狀回顆粒細胞(DGCs)等對這種缺血有一定耐受性。本研究結(jié)果顯示：NGF和TrkA mRNA在假手術(shù)組有一定的表達，在局灶缺血再關注后，海馬組織內(nèi)NGF和TrkA mRNA表達增加。三七總皂甙治療組相應時間點兩項指標增加更明顯，表明三七總皂甙治療可以提高大腦海馬內(nèi)源性NGF和TrkA的表達。本研究說明，三七總皂甙可使NGF、TrkA的mRNA表達上調(diào)，從而促使受損傷海馬組織內(nèi)NGF、TrkA蛋白的表達，提示三七總皂甙可以減輕缺血后繼發(fā)性損傷的機制還可能與NGF和TrkA表達量增加有關。

綜上所述，三七總皂苷通過上調(diào)大鼠腦缺血再灌注損傷時海馬部位NGF和TrkA mRNA含量，從而促進損傷神經(jīng)元的修復和對抗腦缺血后產(chǎn)生的損害因子，避免腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元的死亡和凋亡，從而發(fā)揮其對腦缺血損傷的治療作用，且在起效時間和作用持續(xù)時間上均強于缺血再灌注組。

參考文獻：

［1］ Hou AH. Clinical application and experimental study of pseudoginseng［J］. InfTradit ChinMed，1999，16(6)：21-24.

［2］ 劉建輝，冀鳳云，王婷，等. 三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究［J］.中國臨床神經(jīng)科學， 2002，10(1)：90.

［3］ Longa E Z，Weinstein P R， Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke， 1989， 20(1)：84-91.

［4］ 屈澤強，謝智光，王乃平，等.三七總皂苷抗衰老作用的實驗研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2005，22(2)：130-133.

［5］ Ron D and Habener JF. CHOP， a novel developmentally regulated nuclear protein that dimerizes with transcription factors C/EBP and LAP and functions as a dominant-negative inhibitor of gene transcription［J］. GenesDev，2002，6：439-453.

［6］ Levi-Montalcini R.The nerve growth factor 35 years later［J］.Science，1987， 237： 1154-1162.

（責任編輯：姜付平）