陳艷平 張毅民 王乃平 韋錦斌

[摘要] 目的 研究倍他司汀和西咪替丁對原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體CYP450的影響。方法 以二甲基氨基偶氮苯誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌,觀察倍他司汀和西咪替丁對大鼠第一相酶細胞色素P450的影響。結(jié)果整個實驗過程中,倍他司汀組和西咪替丁組大鼠細胞色素P450含量處于低水平并呈下降趨勢,與模型組比較,差異顯著(P<0.01)。結(jié)論 倍他司汀和西咪替丁可以抑制原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體細胞色素P450活性,從而抑制二甲基氨基偶氮苯在肝臟中的活化而降低他的致癌性及化學(xué)肝損傷。

[關(guān)鍵詞] 原發(fā)性肝癌;倍他司汀;西咪替丁;CYP450

[中圖分類號] R965[文獻標(biāo)識碼] A[文章編號] 1004-8650(2009)06-023-03

The Effects of Betastine and Cimetidine on CYP450 of the Primary Liver Cancer of Wistar Rats

CHEN Yan-ping1, ZHANG Yi-min2, WANG Nai-ping3, WEI Jin-bin3

(1.Changsha Central Hospital Medical Section,HunanChangsha410005China;2.Fujian Provincial Corps Hospital, Chinese People's Armed Police Forces,Fuzhou350003China;3.Guangxi Medical University,GuangxiNanning530021,China)

[Abstract] ObjectiveTo study the effects of betastine and cimetidine on CYP450 of the primary liver cancer of Wister rats。MethodsDimethylamino-axobenzene was used to induce the rat liver cancer model in order to observe the influences of BET and CIM on the content of CYP450。Results During the experiment,the contents of CYP450 in betastine group and cimetidine group were maintained a low level and showed a tendency of decreasing;Compared to the model group,there was significant difference (P<0.01) between them。Conclusion Betastine and cimetidine can decrease the content of CYP450 of the primary liver cancer of Wister rats and also restrained dramatically activity of dimethylamino-axobenzene in the liver of rat and reduced the hepatocarcinoma rate.

[Key words] primary liver cancer;Betastine;Cimetidine;CYP450

CYP450是體內(nèi)參與生物活性物質(zhì)、激素和外來異物包括藥物代謝滅活的重要酶系,酶活性的高低直接影響到物質(zhì)代謝的速度。

倍他司汀(betahistine, BET,抗眩啶)是組胺H1受體激動劑,能增加內(nèi)耳、肝臟等組織血流量,臨床主要用于內(nèi)耳眩暈癥[1]。經(jīng)查新,國內(nèi)外未見BET用于肝癌預(yù)防、治療的報道。王乃平等發(fā)現(xiàn)BET有預(yù)防、治療大鼠原發(fā)性肝癌的趨勢[2],同時,本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)BET為細胞色素P450抑制劑。

西咪替丁(cimetidine,CIM)是一種H2受體拮抗劑,同時也是一種經(jīng)典的細胞色素P450的抑制劑,臨床上用于消化性潰瘍,近年發(fā)現(xiàn)他有抗腫瘤作用,可以抑制許多實驗性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移并可以延長動物的存活期,臨床上被用于抗腫瘤(如大腸癌)[3]。本實驗用二甲基氨基偶氮苯(DAB)誘導(dǎo)大鼠原發(fā)性肝癌模型,以期研究BET和CIM對原發(fā)性肝癌大鼠肝微粒體CYP450的影響。

1材料和方法

1.1動物

Wistar大鼠,雄性,體重(130±20)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2試劑及藥物

BET[日本衛(wèi)材株式會社,衛(wèi)材(蘇州)制藥有限公司分裝,批號:020803]; CIM(原料藥,西南制藥一廠,批號:030220);DAB(上海遠航化工廠,批號:011112);蛋白定量(雙縮脲法)測試盒( 南京建成生物工程研究所,批號:030512)。

1.3主要儀器設(shè)備

高速分散勻質(zhì)機(FJ-200型,上海標(biāo)本模型廠);高速低溫離心機(EppendorfCentrifuge 5804R型,德國);紫外-可見光分光光度計(DU-640G型,美國Beckman公司);雙光束紫外分光光度計(LAMB DAB1020,美國)。

1.4大鼠原發(fā)性肝癌模型的建立及給藥

1.4.1 誘癌藥糧及藥物的配制:用DAB制成6%的花生油溶液,每100ml DAB油溶液與5kg大米拌勻,配成即每克大米含1.2mg DAB的誘癌藥糧;將BET按大鼠7.2mg/kg給藥量用水配成混懸液;將CIM按大鼠100mg/kg給藥量用水配成混懸液。

1.4.2 分組、給藥及模型建立:將雄性Wistar 大鼠隨機分成對照組(30只)、模型組(68只)、BET(45只)組和CIM(45只)組。對照組,用普通大米飼養(yǎng),飲自來水;模型組,用誘癌藥糧飼養(yǎng),飲自來水;BET組和CIM組分別飲用各藥物混懸液,用藥同時,先給普通大米飼養(yǎng)2周,后給誘癌藥糧飼養(yǎng)。模型組和各給藥組均用誘癌藥糧飼養(yǎng),以誘發(fā)肝癌形成,時間為32周。

1.5大鼠肝臟標(biāo)本、肝微粒體及血清的制備

在給誘癌藥糧后第8周、第16周,每組大鼠各取5只,32周后取全部大鼠,稱其體重,拔眼球取血,脫頸椎處死,迅速剖腹取肝臟,稱肝重。剪部分組織用10%甲醛溶液固定,做病理切片檢查。取部分肝臟迅速置于液氮中存放后置-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。余下肝臟用注射器吸取預(yù)冷1.15% KCl沖洗至灰白色,吸干。取肝重0.5左右,加2倍肝重的15%甘油-20mMPBS溶液,用高速分散勻漿機勻漿。將勻漿液于高速成冷凍離心機離心10min(3000rpm),取富含肝微粒體(MS)的上清液,繼續(xù)冷凍離心1h(10000rpm),用15%甘油-20mMPBS溶液1ml稀釋沉淀物,即得肝微粒體(MS),于-80℃冰箱保存?zhèn)錅y。血液凝固后,以3,000rpm,4℃離心15min,取上清即血清,-20℃保存?zhèn)錅y。

1.6CYP450含量測定

取各組不同時期大鼠MS標(biāo)本各5份進行測定,其中蛋白質(zhì)含量測定依蛋白定量測定(雙縮脲法)試劑盒說明書測定肝微粒體MS蛋白含量;參見文獻[4],Beckman比色杯中加入15%甘油-20mMPBS溶液2ml+MS100μl+數(shù)mg保險粉,于Beckman DU-640紫外可見分光光度計調(diào)零,用小兒頭皮針輸液管通入CO 30s,樣品掃描測定,記錄420nm、450nm、490nm處的OD值,根據(jù)公式計算各樣品P450含量。

1.7統(tǒng)計方法

酶學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以SPSS V11.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行t檢驗或?字2檢驗。

2結(jié)果

2.1成癌率

本課題組前期實驗表明,用DAB藥糧誘癌24周后為肝癌形成期,本實驗中所有死亡動物(無法得到完整尸體者除外)經(jīng)解剖或根據(jù)病理檢查,最早1例肝癌出現(xiàn)于25周(模型組),現(xiàn)以25周動物數(shù),25-32周成癌數(shù)計算成癌率。結(jié)果顯示,CIM組和BET組的成癌率顯著低于模型組(Tab. 1)。

2.2CYP450的含量變化

給予大鼠誘癌藥糧8周后,模型組CYP450含量有所增加,與對照組比較有差異(P<0.05);BET組和CIM組CYP450含量處于較低水平,與對照組比較有差異(P<0.05),與模型組比較差異顯著(P<0.01)。16周后,模型組CYP450升高較快達到峰值,與對照組比較差異明顯(P<0.05);BET組和CIM組仍然處于較低水平,與對照組比較差異顯著(Ρ<0.01),而與模型組比較差異顯著(Ρ<0.01)。32周后,模型組CYP450明顯下降,達到最低值,與對照組比較差異顯著(Ρ<0.01);BET組一直處于低水平,與對照組和模型組比較均有差異(Ρ<0.05);CIM組也一直處于低水平,與對照組比較差異明顯(Ρ<0.01),而與模型組比較差異顯著(Ρ<0.01);BET組與CIM組比較三個時期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Tab. 2,Fig.1)。

3討論

本實驗以含DAB的誘癌藥糧進行原發(fā)性肝癌模型復(fù)制,從病理切片可見,模型組大鼠肝癌為高分化的肝細胞肝癌。肝癌發(fā)生率為69.57%,說明肝癌模型復(fù)制成功。而BET組和CIM組大鼠在實驗早期肝臟的損傷程度明顯較模型組輕,成癌率明顯比模型組低,說明BET和CIM可以減輕或延緩大鼠肝損傷,降低成癌率。

DAB為偶氮類化合物,與廣泛存在于環(huán)境中的致癌物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似,是動物實驗性肝癌中的一種致癌率較高的致癌劑。在體內(nèi)DAB經(jīng)肝臟CYP450的N-去甲基化,N-氧化作用及酯化作用,轉(zhuǎn)化為活性致癌物。DAB對肝臟的損傷,一方面表現(xiàn)為非特異性毒性作用,DAB作用于肝細胞,損傷肝細胞一些重要酶系,如定位于細胞線粒體嵴和內(nèi)膜上的琥珀脫氫酶(SDH),定位于肝細胞膜的5,-核苷酸酶(5,-NH)等,使肝細胞發(fā)生變性、壞死,繼而壞死周邊肝細胞明顯再生,膽管上皮增生及大量纖維結(jié)締組織增生而形成假小葉及再生結(jié)節(jié),將肝組織轉(zhuǎn)變成肉眼可見的顆粒型肝硬變,進而肝細胞或膽管上皮過度增生、異型增生以至癌變。個別病例也可能并未形成肝硬化而直接形成肝癌。另一方面,由于DAB可能破壞肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等細胞器,從而影響蛋白質(zhì)合成。組胺受體蛋白的減少,降低了機體對腫瘤細胞的自然免疫反應(yīng),還可能會對組胺的代謝及效應(yīng)產(chǎn)生影響,導(dǎo)致肝細胞及磷脂代謝的紊亂而加重肝細胞的損害,造成惡性循環(huán),促進肝癌癌變的發(fā)展[5]。

CYP450同工酶可分為“解毒”和“增毒”兩大類[6],CYP1A和CYP2E在多種前致癌物或前毒物的代謝活化中起重要的催化作用,屬于"增毒"類CYP450,存在對癌癥的多態(tài)易感性[7]。從CYP450的含量變化曲線可見,模型組大鼠中的CYP450含量先升后降,而BET組與CIM組大鼠一直處于較低水平,并有下降趨勢。本實驗組前期實驗發(fā)現(xiàn)BET與CIM同屬肝藥酶抑制劑,結(jié)合本實驗表明他們可能可以抑制這類"增毒"CYP450活性,從而抑制DAB在肝臟中的活化而降低他的致癌性及化學(xué)肝損傷。當(dāng)然,BET和CIM減輕或延緩大鼠肝損傷、降低成癌率的這種作用或許還與其分別作為組胺的H1受體激動劑和H2受體拮抗劑有關(guān)。組胺通過不同受體產(chǎn)生雙重但相互拮抗的免疫調(diào)節(jié)作用,這與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系,即組胺受體介導(dǎo)的腫瘤雙向效應(yīng)[8]:H1受體興奮可增強免疫反應(yīng),H2受體興奮可抑制免疫反應(yīng)。現(xiàn)已證明,組胺可抑制促分泌素誘導(dǎo)的淋巴細胞增生反應(yīng)[9]。動物及人體中的抑制性T細胞上有組胺H2受體[10],而效應(yīng)T細胞或反抑制性T細胞膜上有組胺H1受體[11]。組胺的免疫抑制效應(yīng)主要由H2受體介導(dǎo),H2受體拮抗劑可以阻斷組胺對淋巴因子和淋巴細胞增殖的抑制,增加對腫瘤細胞的自然免疫反應(yīng),抑制腫瘤細胞的生長[12],說明組胺通過淋巴細胞上H1受體興奮可增強免疫反應(yīng),H2受體興奮可抑制免疫反應(yīng)。因此BET作為H1受體激動劑,CIM作為H2受體拮抗劑都能增強大鼠的免疫反應(yīng),從而減輕或延緩致致癌劑DAB對大鼠肝損傷、降低成癌率。

BET和CIM能減輕或延緩致癌劑DAB對大鼠肝損傷、降低成癌率這種作用的作用機制究竟是因為其抑制這類“增毒”CYP450活性,從而抑制DAB在肝臟中的活化而降低他的致癌性及化學(xué)肝損傷,還是因為與其分別作為組胺的H1受體激動劑和H2受體拮抗劑,從而增強大鼠的免疫反應(yīng)有關(guān),或者是共同作用以及誰占主導(dǎo)作用,還有待進一步研究。

參考文獻:

[1] 胡汝科.倍他司汀治療眩暈癥50例療效觀察. 張大祿主編.臨床軍醫(yī)雜志,2005;33(4): 513-514.

[2] 王乃平, 藏林泉,韋錦斌,等.Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)與肝癌發(fā)生關(guān)系的流行病學(xué)調(diào)查研究. 中華流行病學(xué)雜志, 1997, 18(1-B): 362-364.

[3] Adams WJ, Morris DL. Short-course cimetidine and survival with colorectal cancer Lancet, 1994, 344(8939-40): 1768-1769.

[4] 莫書榮. 實驗生理科學(xué).北京:科學(xué)出版社,2003,8:135.

[5] 朱建思,周建國. 二甲基氨基偶氮苯誘發(fā)大鼠實驗性肝癌的癌前期病理研究. 衡陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1990,18(4):336.

[6] 鞠美華. 細胞色素P450同工酶在外源物代謝中的作用. Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy, 1998, 25(4): 218-223.

[7] 冷欣夫,邱星輝. 細胞色素P450酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景.科學(xué)出版社,2001,91.

[8] 黃峙,郭寶江,向軍儉. 組胺在腫瘤免疫中的雙向調(diào)節(jié)作用. 中國病理生理雜志,2003,19(7):1000-1004.

[9] Bonnet M. Lespinats G. Burtin C et al. Histamine and serotonin suppression of lymphocyte response to phytohemagglutinin and allogentic cells. Cell immunal.1984,83(2): 280-291.

[10] Buetin C, Scheinmann P, Salomon JC, et al. Decrease in tutor growth by injections of histamine or serotonin in fibrosarcoma-bearing mice: influence of H1 and H2 histamine receptors. Br J Cancer. 1982,45(1): 54-60.

[11] Siegel JN, Schwartz A, Askenase PW, et al. T-cell suppression and contrasuppression induced by histamine H2 and H1 receptor agonists respectively. Proc Natl Acal Sci. 1982,79(16): 5052-5056.

[12] 張瑾,王德昌. 組胺與惡性腫瘤的關(guān)系及抗腫瘤作用的研究. 中國腫瘤臨床與康復(fù),1999,6(2): 4-5.

(收稿日期2009-04-06)